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今天分享一篇發(fā)表在Cells(2021年IF=6.6)上的文章,名為《Compositional Features of Distinct Microbiota Base on Serum Extracellular V esicle Metagenomics Analysis in Moderate to Severe Psoriasis Patients》[1]( 基于血清細胞外囊泡宏基因組學分析的中重度銀屑病患者不同菌群的組成特征)。

慢性斑塊狀銀屑病或?qū)こP豌y屑病是銀屑病最常見的形式,其臨床特征是位于頭皮、肘部、膝蓋、臍和腰部的紅色和鱗狀皮膚斑塊反復發(fā)作。銀屑病患者不僅患有炎癥性皮膚病,而且還經(jīng);加胁l(fā)癥,如高脂血癥、二型糖尿病、肥胖癥、炎癥性腸病(IBD)和心血管疾病。顯然,銀屑病是一種全身炎癥性疾病,開發(fā)新的潛在治療策略至關重要。

原核生物和真核生物分泌的細胞外囊泡(EVs)負責細胞間的通訊。EVs的不同內(nèi)容物、大小和濃度反映了其來源細胞的狀態(tài),并作為各種病理狀況的生物標志物。來自供體細胞的EVs的脂質(zhì)雙層膜攜帶內(nèi)容物,如DNA、RNA (microRNA、mRNA、長非編碼RNA)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì),它們隨后聚集到受體細胞的胞質(zhì)溶膠中,從而觸發(fā)免疫調(diào)節(jié)。最近,來自免疫細胞的EVs被證實參與了銀屑病的發(fā)病機制。許多研究表明Th17細胞和Th17途徑在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中起著越來越重要的作用。白細胞介素-17A (IL-17A)作為Th17細胞的下游效應分子,可誘導成纖維細胞和上皮細胞分泌多種細胞因子,促進局部炎癥反應。有研究表明銀屑病皮損中肥大細胞和中性粒細胞數(shù)量的增加有助于致病性細胞因子IL-17A通過EV形成的釋放。也有研究者檢測到銀屑病患者體內(nèi)產(chǎn)生IL-17A的外泌體增多。靶向游離IL-17及其受體的藥物是目前治療銀屑病最有效的方法。EVs的釋放是銀屑病炎癥狀態(tài)下角質(zhì)形成細胞和中性粒細胞之間的雙向交流。銀屑病角質(zhì)形成細胞通過分泌型EVs中的特異性microRNAs誘導Th1/Th17細胞極化,進一步促進銀屑病發(fā)展。除了免疫細胞分泌的EVs作為銀屑病的致病因素外,包封的microRNA被認為是銀屑病的生物標志物。來自細菌的EVs,稱為膜泡(MVs)或外膜泡(OMVs),分別來源于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌,也含有微生物相關的分子模式(MAMPs),如核酸、脂多糖(LPS)、肽聚糖或毒素來調(diào)節(jié)免疫。這些MAMPs被宿主中免疫和非免疫細胞表達的不同家族的模式識別受體(PRRs)識別,并進一步觸發(fā)免疫調(diào)節(jié)信號。無論真核生物和原核生物分泌的腸道病毒如何,腸道病毒的特點是在循環(huán)系統(tǒng)中運輸。皮膚或腸道微生物群的生物失調(diào)是導致先天和適應性免疫不足的危險因素。腸-皮膚軸是銀屑病發(fā)病的關鍵因素。微生物來源的腸道病毒可在體液中檢測到,并在微生物與宿主的相互作用中發(fā)揮重要作用。病原體衍生的EVs已被證明可以調(diào)節(jié)疾病的發(fā)展,如中性粒細胞性肺部炎癥和特應性皮炎。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有益微生物來源的腸道病毒可以改善炎癥并影響遠端宿主細胞。對EV宏基因組的深入分析可能是系統(tǒng)檢測細菌-宿主關系的一種極好手段。研究表明,腸道或皮膚微生物群在銀屑病中起著關鍵作用;然而,沒有研究分析系統(tǒng)性微生物因素。本研究調(diào)查了銀屑病患者和健康對照者血清中微生物EVs的多樣性和豐度。全長16S宏基因組分析確定了生物學和統(tǒng)計學上有意義的細菌EV分類群作為診斷模型。

研究過程:

一、樣本收集

血清標本采集自銀屑病患者(PASI > 10)和既無皮膚病也無任何明顯基礎疾病(如代謝綜合征、腸道疾病和癌癥的健康人。在研究前14天內(nèi),沒有參與者使用益生菌、全身抗生素或類固醇。所有參與者都提供了書面知情同意書,以公布其病例詳情。該研究獲得廈門長庚醫(yī)院倫理委員會批準。

二、EVs分離

通過一系列超速離心從血液樣本中分離出血漿EVs。首先用5倍的PBS稀釋4ml的血樣以降低粘度,然后在4℃以2000× g離心30分鐘除去碎片。將上清液轉(zhuǎn)移到新試管中,并在4℃下以10000× g離心45分鐘。隨后使用0.45 m注射器過濾器過濾上清液,在4℃下以100000× g超速離心70分鐘。將外泌體沉淀重懸于10ml冷PBS中,重復超速離心步驟。將最終的外泌體沉淀重新懸浮在100ul 0.22um過濾的PBS中,用于后續(xù)分析。

三、TEM

用負染的透射電鏡觀察分離的外泌體的形態(tài)。將純化的外泌體稀釋兩倍至10ul的體積,并加到銅網(wǎng)格上1分鐘,用濾紙小心除去過量的外泌體溶液。吸收的外泌體用10ul 2%乙酸鈾酰染色1分鐘,用濾紙除去多余的液體。網(wǎng)格在室溫下干燥幾分鐘,并在80千伏下使用透射電子顯微鏡獲取圖像。

四、納米流式(nanoFCM)檢測

使用納米流式檢測儀(N30E,NanoFCM,中國廈門)分析血清外泌體的濃度和大小。使用200nm二氧化硅納米球混合物來校準分離的血清外泌體的濃度和大小。使用冷PBS (1:4稀釋比)稀釋每個樣品(20ul),隨后,用20ul FITC小鼠抗人CD9和FITC小鼠抗人CD81抗體(BD Biosciences)在37℃染色30分鐘。同型對照作為陰性對照(BD Biosciences)。孵育后,用PBS洗滌兩次,并在4℃下以110000×g離心70分鐘。棄去上清液,將沉淀重懸于50ul冷PBS中。上機進行檢測。

五、Western Blot

使用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒評估EVs的蛋白濃度。使用Western blotting檢測EV標記物:CD9、CD63和calnexin。根據(jù)目標蛋白的分子量,將蛋白質(zhì)裂解物(每孔10ug)加到10%或15%的SDS-PAGE凝膠上。將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到甲醇活化的PVDF膜上。在室溫下,將膜在含有5%脫脂奶粉的封閉緩沖液1× TBST中封閉1小時,然后在4℃下與一抗孵育過夜。過量的一抗用TBST洗滌三次來除去。接下來,將膜與二抗在室溫下孵育1小時,隨后在室溫下用Immobilon? Western Chemiluminescent HRP Substrate 孵育5分鐘,使用ChemiScope 3300 mini進行化學發(fā)光信號檢測。

六、血漿EVs的DNA提取

在提取DNA之前,使用0.22um的過濾器清除EVs中的細菌和外源顆粒。EV樣品100℃煮沸30分鐘,再10000× g離心30分鐘。DNA的質(zhì)量和數(shù)量用 NanoDrop測定。用1%瓊脂糖凝膠確定DNA濃度和純度。

七、文庫制備和測序

所有PCR反應均采用TransStart?FastPfu DNA Polymerase(TransGen Biotech)。對于全長16S rRNA基因測序,根據(jù)16S宏基因組測序文庫制備程序(Pacific Biosciences)使用了一套特異性引物(27F:5'-CCTACGGGNGGCWCAG-3',1492R:5'-GACTACHVGGGTAT CTAATCC-3')。PCR反應產(chǎn)物混合物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離,用SYBR green loading dye染色。PCR反應產(chǎn)物用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)純化。測序文庫用SMRTbell Template Prep Kit (Pacific Biosciences)生成。文庫的質(zhì)量用 Qubit 4.0 fluorometer (Thermo Scientific)和Femto Pulse system (Agilent)進行評估。最后,在PacBio測序平臺上對該文庫進行了測序。

八、 微生物圖譜的處理和分析

使用SMRT Link軟件,在PacBio的官方流程中,循環(huán)一致性序列(CCS)讀數(shù)的最小預測精度為0.9,最小通過次數(shù)設置為3。多路分解后,用DADA2(版本1.10.1)進一步處理CCS讀數(shù),以獲得單核苷酸分辨率的擴增子。DADA2工作流程包括質(zhì)量篩選、去重復、學習數(shù)據(jù)集特定的誤差模型、擴增子序列變異(ASV)推斷和嵌合體去除。對于每一個代表性序列,QIIME2中的特征分類器和classifyconsensus-blast算法被用來基于從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到的信息來注釋分類。

為了分析不同ASVs之間的序列相似性,使用QIIME2比對MAFFT對照NCBI數(shù)據(jù)庫進行了多序列比對。主坐標分析(PCoA)是使用距離矩陣來獲取主坐標,以可視化復雜的多維數(shù)據(jù)。LEfSe將LDA應用于被鑒定為顯著不同的細菌分類群,并進一步評估每個差異豐富分類群的效應大小。在這項研究中,LDA評分(log 10) > 4的分類群被認為是顯著的。對于功能分析,使用PICRUSt (v1.1.1)分析了來自16S rRNA測序數(shù)據(jù)的功能豐度,以預測功能基因。

結(jié)果展示:

一、EVs的分離和鑒定

圖1. A. EVs電鏡照片;B. 納米流式(nanoFCM)測定EVs粒徑分布和 C. 濃度;D. 納米流式(nanoFCM)檢測EVs標志物CD9和CD81的表達量,以及對應的同型對照作為陰性對照;E. Western blot檢測CD9, CD63和calnexin表達水平。

二、 健康人和銀屑病患者不同微生物群的差異

圖2. 健康人和銀屑病患者血漿細菌群落的α多樣性指標。

三、 優(yōu)勢菌在不同染色體水平上的分布

圖3. 健康人和銀屑病患者不同微生物群中的β-多樣性。

圖4. 前10種相對豐度分布

四、健康人和銀屑病患者微生物群組成的差異分析

圖5. 兩組間物種多樣性分析。

結(jié)果就展示這么多,有興趣的話可以自己找這篇文獻具體看,或者私聊我要文獻資料,有理解得不對的地方,歡迎專業(yè)人士指正,一起交流~

參考文獻:

[1]Chang, CJ; Zhang, J; Tsai, YL; et al.Compositional Features of Distinct Microbiota Base on Serum Extracellular Vesicle Metagenomics Analysis in Moderate to Severe Psoriasis Patients.[J].Cells.2021,10(9):

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