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科研bxnb新蟲 (初入文壇)
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活體成像捕捉細(xì)胞一舉一動(dòng)，讓腫瘤細(xì)胞無所遁形！
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活體成像主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶（Luciferase）基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基團(tuán)（GFP、RFP、Cyt及dyes等）進(jìn)行標(biāo)記。采用一套非常靈敏的光學(xué)檢測(cè)儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為。通過這個(gè)系統(tǒng)，可以觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過程。傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法需要在不同的時(shí)間點(diǎn)宰殺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以獲得數(shù)據(jù)，得到多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。相比之下，可見光體內(nèi)成像通過對(duì)同一組實(shí)驗(yàn)對(duì)象在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行記錄，跟蹤同一觀察目標(biāo)（標(biāo)記細(xì)胞及基因）的移動(dòng)及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實(shí)可信。另外，這一技術(shù)對(duì)腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè)靈敏度極高，不涉及放射性物質(zhì)和方法，非常安全。因其操作極其簡(jiǎn)單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點(diǎn)，在剛剛發(fā)展起來的幾年時(shí)間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面。 No.1 實(shí)驗(yàn)過程 通過分子生物學(xué)克隆技術(shù)，應(yīng)用單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選，將熒光素酶的基因穩(wěn)定整合到預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶蛋白的細(xì)胞株。 典型的成像過程是：小鼠經(jīng)過麻醉系統(tǒng)被麻醉后放入成像暗箱平臺(tái)，軟件控制平臺(tái)的升降到一個(gè)合適的視野，自動(dòng)開啟照明燈拍攝第一次背景圖。下一步，自動(dòng)關(guān)閉照明燈，在沒有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的光，即為生物發(fā)光成像。與第一次的背景圖疊加后可以清楚的顯示動(dòng)物體內(nèi)光源的位置，完成成像操作。之后，軟件完成圖像分析過程。使用者可以方便的選取感興趣的區(qū)域進(jìn)行測(cè)量和數(shù)據(jù)處理及保存工作。當(dāng)選定需要測(cè)量的區(qū)域后，軟件可以計(jì)算出此區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。軟件的數(shù)據(jù)處理和保存功能非常強(qiáng)大，可以加快實(shí)驗(yàn)速度，方便大批量的實(shí)驗(yàn)。 No.2 技術(shù)應(yīng)用 通過活體動(dòng)物體內(nèi)成像系統(tǒng)，可以觀測(cè)到疾病或癌癥的發(fā)展進(jìn)程以及藥物治療所產(chǎn)生的反應(yīng)，并可用于病毒學(xué)研究、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型、siRNA研究、干細(xì)胞研究、蛋白質(zhì)相互作用研究以及細(xì)胞體外檢測(cè)等領(lǐng)域。具體應(yīng)用如下： 01. 標(biāo)記細(xì)胞 (1) 癌癥與抗癌藥物研究 直接快速地測(cè)量各種癌癥模型中腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并可對(duì)癌癥治療中癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估�；铙w生物發(fā)光成像能夠無創(chuàng)傷地定量檢測(cè)小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。 (2) 免疫學(xué)與干細(xì)胞研究 將熒光素酶標(biāo)記的造血干細(xì)胞移植入脾及骨髓，可用于實(shí)時(shí)觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)干細(xì)胞造血過程的早期事件及動(dòng)力學(xué)變化。有研究表明，應(yīng)用帶有生物發(fā)光標(biāo)記基因的小鼠淋巴細(xì)胞，檢測(cè)放射及化學(xué)藥物治療的效果，尋找在腫瘤骨髓轉(zhuǎn)移及抗腫瘤免疫治療中復(fù)雜的細(xì)胞機(jī)制。應(yīng)用可見光活體成像原理標(biāo)記細(xì)胞，建立動(dòng)物模型，可有效的針對(duì)同一組動(dòng)物進(jìn)行連續(xù)的觀察，節(jié)約動(dòng)物樣品數(shù)，同時(shí)能更快捷地得到免疫系統(tǒng)中病原的轉(zhuǎn)移途徑及抗性蛋白表達(dá)的改變。 (3) 細(xì)胞凋亡 當(dāng)熒光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生的融合蛋白無熒光素酶活性，細(xì)胞不能發(fā)光，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，活化的caspase-3在特異識(shí)別位點(diǎn)切割去掉抑制蛋白，恢復(fù)熒光素酶活性，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，由此可用于觀察活體動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞凋亡相關(guān)事件。 02. 標(biāo)記病毒 (1) 病毒侵染 以熒光素酶基因標(biāo)記的HSV-1病毒為例，可觀察到HSV-1病毒對(duì)肝臟、肺、脾及淋巴結(jié)的侵和病毒從血液系統(tǒng)進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)的過程。多種病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒，慢病毒，乙肝病毒等，已被熒光素酶標(biāo)記，用于觀察病毒對(duì)機(jī)體的侵染過程。 (2) 基因治療 基因治療包括在體內(nèi)將一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因及其產(chǎn)物安全而有效的傳遞到靶細(xì)胞�？蓱�(yīng)用熒光素酶基因作為報(bào)告基因用于載體的構(gòu)建，觀察目的基因是否能夠在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)高效和組織特異性表達(dá)。這種非侵入方式具有容易準(zhǔn)備、低毒性及輕微免疫反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。熒光素酶基因也可以插入脂質(zhì)體包裹的DNA分子中，用來觀察脂質(zhì)體為載體的DNA運(yùn)輸和基因治療情況。 03. 標(biāo)記細(xì)菌 (1) 細(xì)菌侵染研究 可以用標(biāo)記好的革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌侵染活體動(dòng)物，觀測(cè)其在動(dòng)物體內(nèi)的繁殖部位、數(shù)量變化及對(duì)外界因素的反應(yīng)。 (2) 抗生素藥物 利用標(biāo)記好的細(xì)菌在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)藥物的反應(yīng)，醫(yī)藥公司和研究機(jī)構(gòu)可用這種成像技術(shù)進(jìn)行藥物篩選和臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。 04. 基因表達(dá)和蛋白質(zhì)相互作用 (1) 組織特異性基因表達(dá) 熒光素酶（luciferase）是一類生物發(fā)光酶，其中的renilla熒光素酶和firefly熒光素酶分別識(shí)別不同的底物，一種細(xì)胞可被這兩種熒光素酶標(biāo)記:renilla熒光素酶基因由一組成性穩(wěn)定表達(dá)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，作為內(nèi)參，反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的變化;firefly熒光素酶基因由要研究的組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。這樣firefly熒光素酶發(fā)光信號(hào)的變化，在消除細(xì)胞數(shù)量變化的影響后就可反應(yīng)特定的啟動(dòng)子在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)活性。 (2) 蛋白質(zhì)相互作用 觀察細(xì)胞中或活體動(dòng)物體內(nèi)兩種蛋白質(zhì)的相互作用，是將熒光素酶基因分成兩段，分別連接所研究的兩種蛋白之一的編碼DNA，然后導(dǎo)入細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)為融合蛋白。當(dāng)兩種蛋白有強(qiáng)相互作用時(shí)，表達(dá)的熒光素酶兩部分相互靠近形成有活性的熒光素酶，在有底物存在時(shí)出現(xiàn)生物發(fā)光，反映出所研究的兩種蛋白存在相互作用。應(yīng)用此原理亦可用于研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑。 (3) 阻斷RNA 通過對(duì)比生物發(fā)光的變化，驗(yàn)證在成年小鼠體內(nèi)，注射雙鏈siRNA可以特異地阻遏基因表達(dá)。 05. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型 (1) 基因表達(dá) 為研究目的基因是在何時(shí)、何種刺激下表達(dá)，將熒光素酶基因插入目的基因啟動(dòng)子的下游，并穩(wěn)定整合于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。利用其表達(dá)產(chǎn)生的熒光素酶與底物作用產(chǎn)生生物發(fā)光，反應(yīng)目的基因的表達(dá)情況，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的研究。可用于研究動(dòng)物發(fā)育過程中特定基因的時(shí)空表達(dá)情況，觀察藥物誘導(dǎo)特定基因表達(dá)，以及其它生物學(xué)事件引起的相應(yīng)基因表達(dá)或關(guān)閉。 (2) 各種疾病模型 研究者根據(jù)研究目的，將靶基因、靶細(xì)胞、病毒及細(xì)菌進(jìn)行熒光素酶標(biāo)記，同時(shí)轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)形成所需的疾病模型，包括腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染疾病等等�？商峁┌谢蛟隗w內(nèi)的實(shí)時(shí)表達(dá)和對(duì)候選藥物的準(zhǔn)確反應(yīng)，還可以用來評(píng)估候選藥物和其它化合物的毒性。為藥物在疾病中的作用機(jī)制及效用提供研究方法 |
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