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科研bxnb新蟲 (初入文壇)
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[交流]
活體成像捕捉細胞一舉一動，讓腫瘤細胞無所遁形！
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活體成像主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶（Luciferase）基因標(biāo)記細胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報告基團（GFP、RFP、Cyt及dyes等）進行標(biāo)記。采用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細胞活動和基因行為。通過這個系統(tǒng)，可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達等生物學(xué)過程。傳統(tǒng)的動物實驗方法需要在不同的時間點宰殺實驗動物以獲得數(shù)據(jù)，得到多個時間點的實驗結(jié)果。相比之下，可見光體內(nèi)成像通過對同一組實驗對象在不同時間點進行記錄，跟蹤同一觀察目標(biāo)（標(biāo)記細胞及基因）的移動及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實可信。另外，這一技術(shù)對腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測靈敏度極高，不涉及放射性物質(zhì)和方法，非常安全。因其操作極其簡單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點，在剛剛發(fā)展起來的幾年時間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面。 No.1 實驗過程 通過分子生物學(xué)克隆技術(shù)，應(yīng)用單克隆細胞技術(shù)的篩選，將熒光素酶的基因穩(wěn)定整合到預(yù)期觀察的細胞的染色體內(nèi)，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶蛋白的細胞株。 典型的成像過程是：小鼠經(jīng)過麻醉系統(tǒng)被麻醉后放入成像暗箱平臺，軟件控制平臺的升降到一個合適的視野，自動開啟照明燈拍攝第一次背景圖。下一步，自動關(guān)閉照明燈，在沒有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的光，即為生物發(fā)光成像。與第一次的背景圖疊加后可以清楚的顯示動物體內(nèi)光源的位置，完成成像操作。之后，軟件完成圖像分析過程。使用者可以方便的選取感興趣的區(qū)域進行測量和數(shù)據(jù)處理及保存工作。當(dāng)選定需要測量的區(qū)域后，軟件可以計算出此區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，獲得實驗數(shù)據(jù)。軟件的數(shù)據(jù)處理和保存功能非常強大，可以加快實驗速度，方便大批量的實驗。 No.2 技術(shù)應(yīng)用 通過活體動物體內(nèi)成像系統(tǒng)，可以觀測到疾病或癌癥的發(fā)展進程以及藥物治療所產(chǎn)生的反應(yīng)，并可用于病毒學(xué)研究、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型、siRNA研究、干細胞研究、蛋白質(zhì)相互作用研究以及細胞體外檢測等領(lǐng)域。具體應(yīng)用如下： 01. 標(biāo)記細胞 (1) 癌癥與抗癌藥物研究 直接快速地測量各種癌癥模型中腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并可對癌癥治療中癌細胞的變化進行實時觀測和評估�；铙w生物發(fā)光成像能夠無創(chuàng)傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。 (2) 免疫學(xué)與干細胞研究 將熒光素酶標(biāo)記的造血干細胞移植入脾及骨髓，可用于實時觀測活體動物體內(nèi)干細胞造血過程的早期事件及動力學(xué)變化。有研究表明，應(yīng)用帶有生物發(fā)光標(biāo)記基因的小鼠淋巴細胞，檢測放射及化學(xué)藥物治療的效果，尋找在腫瘤骨髓轉(zhuǎn)移及抗腫瘤免疫治療中復(fù)雜的細胞機制。應(yīng)用可見光活體成像原理標(biāo)記細胞，建立動物模型，可有效的針對同一組動物進行連續(xù)的觀察，節(jié)約動物樣品數(shù)，同時能更快捷地得到免疫系統(tǒng)中病原的轉(zhuǎn)移途徑及抗性蛋白表達的改變。 (3) 細胞凋亡 當(dāng)熒光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳動物細胞中表達，產(chǎn)生的融合蛋白無熒光素酶活性，細胞不能發(fā)光，而當(dāng)細胞發(fā)生凋亡時，活化的caspase-3在特異識別位點切割去掉抑制蛋白，恢復(fù)熒光素酶活性，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，由此可用于觀察活體動物體內(nèi)的細胞凋亡相關(guān)事件。 02. 標(biāo)記病毒 (1) 病毒侵染 以熒光素酶基因標(biāo)記的HSV-1病毒為例，可觀察到HSV-1病毒對肝臟、肺、脾及淋巴結(jié)的侵和病毒從血液系統(tǒng)進入神經(jīng)系統(tǒng)的過程。多種病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒，慢病毒，乙肝病毒等，已被熒光素酶標(biāo)記，用于觀察病毒對機體的侵染過程。 (2) 基因治療 基因治療包括在體內(nèi)將一個或多個感興趣的基因及其產(chǎn)物安全而有效的傳遞到靶細胞�？蓱�(yīng)用熒光素酶基因作為報告基因用于載體的構(gòu)建，觀察目的基因是否能夠在試驗動物體內(nèi)持續(xù)高效和組織特異性表達。這種非侵入方式具有容易準(zhǔn)備、低毒性及輕微免疫反應(yīng)的優(yōu)點。熒光素酶基因也可以插入脂質(zhì)體包裹的DNA分子中，用來觀察脂質(zhì)體為載體的DNA運輸和基因治療情況。 03. 標(biāo)記細菌 (1) 細菌侵染研究 可以用標(biāo)記好的革蘭氏陽性和陰性細菌侵染活體動物，觀測其在動物體內(nèi)的繁殖部位、數(shù)量變化及對外界因素的反應(yīng)。 (2) 抗生素藥物 利用標(biāo)記好的細菌在動物體內(nèi)對藥物的反應(yīng)，醫(yī)藥公司和研究機構(gòu)可用這種成像技術(shù)進行藥物篩選和臨床前動物實驗研究。 04. 基因表達和蛋白質(zhì)相互作用 (1) 組織特異性基因表達 熒光素酶（luciferase）是一類生物發(fā)光酶，其中的renilla熒光素酶和firefly熒光素酶分別識別不同的底物，一種細胞可被這兩種熒光素酶標(biāo)記:renilla熒光素酶基因由一組成性穩(wěn)定表達的啟動子驅(qū)動，作為內(nèi)參，反應(yīng)細胞數(shù)量的變化;firefly熒光素酶基因由要研究的組織特異性啟動子驅(qū)動。這樣firefly熒光素酶發(fā)光信號的變化，在消除細胞數(shù)量變化的影響后就可反應(yīng)特定的啟動子在動物體內(nèi)的表達活性。 (2) 蛋白質(zhì)相互作用 觀察細胞中或活體動物體內(nèi)兩種蛋白質(zhì)的相互作用，是將熒光素酶基因分成兩段，分別連接所研究的兩種蛋白之一的編碼DNA，然后導(dǎo)入細胞或動物體內(nèi)表達為融合蛋白。當(dāng)兩種蛋白有強相互作用時，表達的熒光素酶兩部分相互靠近形成有活性的熒光素酶，在有底物存在時出現(xiàn)生物發(fā)光，反映出所研究的兩種蛋白存在相互作用。應(yīng)用此原理亦可用于研究細胞信號傳導(dǎo)途徑。 (3) 阻斷RNA 通過對比生物發(fā)光的變化，驗證在成年小鼠體內(nèi)，注射雙鏈siRNA可以特異地阻遏基因表達。 05. 轉(zhuǎn)基因動物模型 (1) 基因表達 為研究目的基因是在何時、何種刺激下表達，將熒光素酶基因插入目的基因啟動子的下游，并穩(wěn)定整合于實驗動物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動物模型。利用其表達產(chǎn)生的熒光素酶與底物作用產(chǎn)生生物發(fā)光，反應(yīng)目的基因的表達情況，從而實現(xiàn)對目的基因的研究�？捎糜谘芯縿游锇l(fā)育過程中特定基因的時空表達情況，觀察藥物誘導(dǎo)特定基因表達，以及其它生物學(xué)事件引起的相應(yīng)基因表達或關(guān)閉。 (2) 各種疾病模型 研究者根據(jù)研究目的，將靶基因、靶細胞、病毒及細菌進行熒光素酶標(biāo)記，同時轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)形成所需的疾病模型，包括腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染疾病等等�？商峁┌谢蛟隗w內(nèi)的實時表達和對候選藥物的準(zhǔn)確反應(yīng)，還可以用來評估候選藥物和其它化合物的毒性。為藥物在疾病中的作用機制及效用提供研究方法 |
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2樓2021-11-15 11:24:12
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