 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1063 | 回復: 0 | |||
醫(yī)學生物科研銅蟲 (小有名氣)
|
[交流]
流式與線粒體—MPTP開放檢測
|
|
線粒體是細胞生命活動的重要組成部分,素有“動力工廠”之稱,是能量代謝的主要場所,同時也是對各種損傷最為敏感的細胞器之一。線粒體的結構損傷主要表現(xiàn)為腫脹、膜損傷和嵴斷裂;功能損傷主要表現(xiàn)為MPTP開放,引起 喪失及CytC和AIF釋放等,同時產(chǎn)生ROS,最終導致細胞凋亡。下面我們來介紹一下流式細胞術檢測MPTP的開放情況。 線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrial permeablity transition pore,mPTP),線粒體巨型通道(magachannel),是存在于線粒體內(nèi)外膜之間的一類蛋白復合體,由多種蛋白亞基組成,是存在于線粒體內(nèi)外膜之間的一種高非特異性導電性通道。MPTP與細胞的生存、凋亡密切相關,對于MPTP的檢測也滲透于缺血 / 再灌注、腫瘤、衰老、神經(jīng)變性等多個領域。 檢測原理】 正常情況下線粒體內(nèi)會維持較高的Ca2+濃度,以利于肌肉的正常興奮、收縮和舒張,減少胞漿中Ca2+濃度升高對骨骼肌超微結構的破壞,同時也是敏感性線粒體酶(丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶)發(fā)揮功能所必需的。 大多數(shù)的線粒體會與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有一個接觸點,并建立有穩(wěn)固的連接。有研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+釋放后一部分進入胞漿引起胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高,一部分會被臨近的線粒體募集吸收,此時低電導滲透性轉換孔在張開和閉合中來回切換。當細胞受到損傷時,低電導滲透性轉換孔滲透性發(fā)生改變,Ca2+ 過載,導致MPTP激活。 此時向該細胞中加入熒光探針——鈣黃綠素乙酰甲酯(calcein acetoxymethyl ester, 即Calcein AM;一種非極性染料,可以對活細胞進行熒光染色。Calcein AM通過被動運輸進入細胞內(nèi)并在細胞質(zhì)組分包括線粒體等中積累。Calcein AM在細胞內(nèi)能被酯酶水解去除乙酰甲酯,生成沒有膜通透性的極性熒光染料鈣黃綠素(Calcein or Fluorexon),從而使Calcein滯留在細胞內(nèi)以及線粒體中,使得細胞質(zhì)包括線粒體等呈現(xiàn)強綠色熒光)。再加入CoCl2用于淬滅細胞質(zhì)中Calcein的綠色熒光。正常情況下線粒體的MPTP是關閉的,CoCl2不能進入線粒體,因此在正常細胞中只是胞漿中的Calcein被淬滅;但是損傷的細胞MPTP有一定程度的開放,此時CoCl2便可以進入線粒體,因此在損傷細胞中除了胞漿中的所有Calcein被淬滅外,線粒體中的Calcein也有不同程度的淬滅。此時我們可以通過流式細胞儀檢測Calcein的綠色熒光信號,通過比較熒光信號的強度判斷MPTP的開放程度,進而推斷線粒體的損傷程度。 【檢測流程】 以線粒體通透性轉換孔(MPTP)檢測試劑盒操作步驟為例: a.貼壁細胞胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸、懸浮細胞直接使用,計數(shù),取適量細胞1000g室溫離心5min,棄上清,加入適當體積的檢測緩沖液、Calcein AM染色液、熒光淬滅工作液或Ionomycin對照重懸,使細胞為單細胞懸液,并且細胞密度為1×106/ml,每個樣品體積為1ml。注:需要準備好僅含檢測緩沖液的細胞樣品用作流式細胞儀檢測時的陰性對照。 b.37℃避光孵育30min。 c.孵育完成后,1000g室溫離心5min收集細胞。每個樣品加入1ml檢測緩沖液,輕輕重懸,1000g室溫離心5min收集細胞。 d.用400μl檢測緩沖液重懸細胞。 注意整個過程均需避光操作。染色后,將樣品置于冰上,可以在1小時內(nèi)進行流式細胞儀檢測和分析。 e.注意使用僅含檢測緩沖液的并且未經(jīng)染色的細胞樣品用于流式細胞儀的陰性對照設置。Calcein的最大激發(fā)光波長為494nm,最大發(fā)射光波長為517nm FLOWJO分析結果顯示,正常細胞MFI值為:1703,損傷細胞MFI值為:339。損傷細胞熒光強度明顯低于正常細胞。 |
回復此樓» 猜你喜歡
新疆大學地質(zhì)與礦業(yè)工程學院招生
已經(jīng)有10人回復
-
招調(diào)劑
已經(jīng)有11人回復
-
0856材料與化工求調(diào)劑！
已經(jīng)有11人回復
-
材料與化工304求調(diào)劑
已經(jīng)有10人回復
-
歡迎211本科同學，過A區(qū)國家線，A區(qū)非偏遠一本，交叉學科課題組
已經(jīng)有23人回復
-
A區(qū)一本交叉課題組，低分調(diào)劑，招收機械電子信息通信等交叉方向
已經(jīng)有31人回復
-
中科大材料299求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復
-
301求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復
-
材料考研339求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復
-
材料專碩290求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復
» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關版塊跳轉
我要訂閱樓主 醫(yī)學生物科研 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +4 | 倘若起風了呢 2026-03-05 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 324求調(diào)劑 +5 | wxz2 2026-03-03 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +3 | forgman95 2026-03-05 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 282求調(diào)劑 +7 | 夕～日 2026-03-05 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 歡迎采礦、地質(zhì)、巖土、計算機、人工智能等專業(yè)的同學報考 +10 | pin8023 2026-02-28 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 334求調(diào)劑 +3 | Trying] 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考博] 申博 +3 | 添菜了哈 2026-03-04 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料學碩080500復試調(diào)劑294 +3 | 四葉zjz 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿985材料與化工 326分求調(diào)劑 +3 | Hz795795 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703化學求調(diào)劑，總分320分，一志愿中南民族大學 +3 | 19286712440 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 能動297求調(diào)劑，本科川大 +4 | 邵11 2026-03-04 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +3 | 我是小小蔥蔥 2026-03-03 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085601 材料305分求助 +4 | 泡泡郵件 2026-03-03 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 化工專碩348，一志愿985求調(diào)劑 +8 | 弗格個 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 0856材料調(diào)劑 +5 | 沿岸有貝殼OUC 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +5 | 今夏不夏 2026-03-01 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 291 求調(diào)劑 +3 | 化工2026屆畢業(yè)?/a> 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 328求調(diào)劑 +3 | aaadim 2026-03-01 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +6 | 亭亭亭01 2026-03-01 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +9 | 南迦720 2026-02-28 | 10/500 |
|