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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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流式與線粒體—MPTP開放檢測(cè)
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線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要組成部分,素有“動(dòng)力工廠”之稱,是能量代謝的主要場(chǎng)所,同時(shí)也是對(duì)各種損傷最為敏感的細(xì)胞器之一。線粒體的結(jié)構(gòu)損傷主要表現(xiàn)為腫脹、膜損傷和嵴斷裂;功能損傷主要表現(xiàn)為MPTP開放,引起 喪失及CytC和AIF釋放等,同時(shí)產(chǎn)生ROS,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。下面我們來介紹一下流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MPTP的開放情況。 線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore,mPTP),線粒體巨型通道(magachannel),是存在于線粒體內(nèi)外膜之間的一類蛋白復(fù)合體,由多種蛋白亞基組成,是存在于線粒體內(nèi)外膜之間的一種高非特異性導(dǎo)電性通道。MPTP與細(xì)胞的生存、凋亡密切相關(guān),對(duì)于MPTP的檢測(cè)也滲透于缺血 / 再灌注、腫瘤、衰老、神經(jīng)變性等多個(gè)領(lǐng)域。 檢測(cè)原理】 正常情況下線粒體內(nèi)會(huì)維持較高的Ca2+濃度,以利于肌肉的正常興奮、收縮和舒張,減少胞漿中Ca2+濃度升高對(duì)骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的破壞,同時(shí)也是敏感性線粒體酶(丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶)發(fā)揮功能所必需的。 大多數(shù)的線粒體會(huì)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有一個(gè)接觸點(diǎn),并建立有穩(wěn)固的連接。有研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+釋放后一部分進(jìn)入胞漿引起胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高,一部分會(huì)被臨近的線粒體募集吸收,此時(shí)低電導(dǎo)滲透性轉(zhuǎn)換孔在張開和閉合中來回切換。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí),低電導(dǎo)滲透性轉(zhuǎn)換孔滲透性發(fā)生改變,Ca2+ 過載,導(dǎo)致MPTP激活。 此時(shí)向該細(xì)胞中加入熒光探針——鈣黃綠素乙酰甲酯(calcein acetoxymethyl ester, 即Calcein AM;一種非極性染料,可以對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光染色。Calcein AM通過被動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并在細(xì)胞質(zhì)組分包括線粒體等中積累。Calcein AM在細(xì)胞內(nèi)能被酯酶水解去除乙酰甲酯,生成沒有膜通透性的極性熒光染料鈣黃綠素(Calcein or Fluorexon),從而使Calcein滯留在細(xì)胞內(nèi)以及線粒體中,使得細(xì)胞質(zhì)包括線粒體等呈現(xiàn)強(qiáng)綠色熒光)。再加入CoCl2用于淬滅細(xì)胞質(zhì)中Calcein的綠色熒光。正常情況下線粒體的MPTP是關(guān)閉的,CoCl2不能進(jìn)入線粒體,因此在正常細(xì)胞中只是胞漿中的Calcein被淬滅;但是損傷的細(xì)胞MPTP有一定程度的開放,此時(shí)CoCl2便可以進(jìn)入線粒體,因此在損傷細(xì)胞中除了胞漿中的所有Calcein被淬滅外,線粒體中的Calcein也有不同程度的淬滅。此時(shí)我們可以通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)Calcein的綠色熒光信號(hào),通過比較熒光信號(hào)的強(qiáng)度判斷MPTP的開放程度,進(jìn)而推斷線粒體的損傷程度。 【檢測(cè)流程】 以線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)檢測(cè)試劑盒操作步驟為例: a.貼壁細(xì)胞胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸、懸浮細(xì)胞直接使用,計(jì)數(shù),取適量細(xì)胞1000g室溫離心5min,棄上清,加入適當(dāng)體積的檢測(cè)緩沖液、Calcein AM染色液、熒光淬滅工作液或Ionomycin對(duì)照重懸,使細(xì)胞為單細(xì)胞懸液,并且細(xì)胞密度為1×106/ml,每個(gè)樣品體積為1ml。注:需要準(zhǔn)備好僅含檢測(cè)緩沖液的細(xì)胞樣品用作流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)的陰性對(duì)照。 b.37℃避光孵育30min。 c.孵育完成后,1000g室溫離心5min收集細(xì)胞。每個(gè)樣品加入1ml檢測(cè)緩沖液,輕輕重懸,1000g室溫離心5min收集細(xì)胞。 d.用400μl檢測(cè)緩沖液重懸細(xì)胞。 注意整個(gè)過程均需避光操作。染色后,將樣品置于冰上,可以在1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析。 e.注意使用僅含檢測(cè)緩沖液的并且未經(jīng)染色的細(xì)胞樣品用于流式細(xì)胞儀的陰性對(duì)照設(shè)置。Calcein的最大激發(fā)光波長(zhǎng)為494nm,最大發(fā)射光波長(zhǎng)為517nm FLOWJO分析結(jié)果顯示,正常細(xì)胞MFI值為:1703,損傷細(xì)胞MFI值為:339。損傷細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯低于正常細(xì)胞。 |
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