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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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決定凝膠遷移實(shí)驗(yàn)成功的3要素-百奧思科生物
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凝膠遷移（EMSA）實(shí)驗(yàn)是研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，用于驗(yàn)證基因的反式作用因子與順式作用元件如轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的互做關(guān)系。可用于定性和定量，也可用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 將蛋白或蛋白提取液與探針混合孵育，用凝膠電泳的方法分離混合液的各個(gè)組分，探針遷移速率大，蛋白-探針復(fù)合物因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的存在，遷移速率變慢。因此，根據(jù)電泳帶的位置判斷探針是否能和蛋白結(jié)合。 探針設(shè)計(jì) 經(jīng)典的EMSA實(shí)驗(yàn)使用32P放射性同位素標(biāo)記探針，但目前常用熒光、地高辛或生物素等非放射性標(biāo)記。探針的序列根據(jù)已有的文獻(xiàn)或前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果確定，注意探針不要有復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)和自身互補(bǔ)序列，探針長(zhǎng)度一般30-100堿基。 實(shí)驗(yàn)步驟 Step.1 探針標(biāo)記 熒光標(biāo)記在探針合成時(shí)加入，地高辛或生物素目前已有商品化的探針標(biāo)記試劑盒，按照試劑盒進(jìn)行操作即可。探針標(biāo)記后純化。 Step.2 蛋白樣品 EMSA實(shí)驗(yàn)的蛋白樣品可以是純化的蛋白，用于確定探針是否可以與確定的蛋白結(jié)合；也可以是細(xì)胞或細(xì)胞核蛋白提取液。 Step.3 結(jié)合反應(yīng) 蛋白樣品2-5μg，poly d(I-C)1μL，5X結(jié)合緩沖液2μL，滅菌超純水將總體積補(bǔ)至9μL。混勻后，冰浴5分鐘。 加入探針1μL，室溫（20-25℃）孵育30分鐘。 Step.4 電泳 配制6.5%非變性聚丙烯酰胺膠，加樣前先在4℃、0.5X TBE中預(yù)電泳10-15分鐘。 加樣，4℃條件下電泳大約1小時(shí)，至指示帶接近凝膠底部。 Step.5 轉(zhuǎn)膜 凝膠、尼龍膜用0.5X TBE浸泡后在4℃條件下轉(zhuǎn)膜。 Step.6 探針標(biāo)記 根據(jù)探針的標(biāo)記，按照相應(yīng)的步驟顯色。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) Step.1 驗(yàn)證性EMSA 用于驗(yàn)證特定的序列是否可以與蛋白結(jié)合，但不能確定與探針結(jié)合的蛋白。 Step.2 競(jìng)爭(zhēng)性EMSA 在反應(yīng)體系中同時(shí)加入未標(biāo)記的探針，如果探針與蛋白的結(jié)合是特異的，與僅加入標(biāo)記探針的反應(yīng)相比，蛋白-探針復(fù)合物的信號(hào)會(huì)降低甚至消失。 Step.3 超遷移EMSA 超遷移EMSA一般應(yīng)該在EMSA實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成功的基礎(chǔ)上進(jìn)行。 如果蛋白樣品不是純化蛋白而是混合物，驗(yàn)證性和競(jìng)爭(zhēng)性EMSA都不能鑒定出與探針結(jié)合的蛋白。在反應(yīng)體系中加入特定的蛋白抗體，抗體與蛋白-探針復(fù)合物結(jié)合，抗體-蛋白-探針復(fù)合物的電泳遷移變慢，因此，可以確定探針是否與特定的蛋白結(jié)合。 附：蛋白DNA結(jié)合緩沖液配方（5X） |
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