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醫(yī)學生物科研銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
決定凝膠遷移實驗成功的3要素-百奧思科生物
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凝膠遷移（EMSA）實驗是研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術，用于驗證基因的反式作用因子與順式作用元件如轉錄因子與啟動子的互做關系。可用于定性和定量，也可用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 將蛋白或蛋白提取液與探針混合孵育，用凝膠電泳的方法分離混合液的各個組分，探針遷移速率大，蛋白-探針復合物因為蛋白質的存在，遷移速率變慢。因此，根據電泳帶的位置判斷探針是否能和蛋白結合。 探針設計 經典的EMSA實驗使用32P放射性同位素標記探針，但目前常用熒光、地高辛或生物素等非放射性標記。探針的序列根據已有的文獻或前期實驗的結果確定，注意探針不要有復雜的二級結構和自身互補序列，探針長度一般30-100堿基。 實驗步驟 Step.1 探針標記 熒光標記在探針合成時加入，地高辛或生物素目前已有商品化的探針標記試劑盒，按照試劑盒進行操作即可。探針標記后純化。 Step.2 蛋白樣品 EMSA實驗的蛋白樣品可以是純化的蛋白，用于確定探針是否可以與確定的蛋白結合；也可以是細胞或細胞核蛋白提取液。 Step.3 結合反應 蛋白樣品2-5μg，poly d(I-C)1μL，5X結合緩沖液2μL，滅菌超純水將總體積補至9μL�；靹蚝螅�5分鐘。 加入探針1μL，室溫（20-25℃）孵育30分鐘。 Step.4 電泳 配制6.5%非變性聚丙烯酰胺膠，加樣前先在4℃、0.5X TBE中預電泳10-15分鐘。 加樣，4℃條件下電泳大約1小時，至指示帶接近凝膠底部。 Step.5 轉膜 凝膠、尼龍膜用0.5X TBE浸泡后在4℃條件下轉膜。 Step.6 探針標記 根據探針的標記，按照相應的步驟顯色。 實驗設計 Step.1 驗證性EMSA 用于驗證特定的序列是否可以與蛋白結合，但不能確定與探針結合的蛋白。 Step.2 競爭性EMSA 在反應體系中同時加入未標記的探針，如果探針與蛋白的結合是特異的，與僅加入標記探針的反應相比，蛋白-探針復合物的信號會降低甚至消失。 Step.3 超遷移EMSA 超遷移EMSA一般應該在EMSA實驗已經成功的基礎上進行。 如果蛋白樣品不是純化蛋白而是混合物，驗證性和競爭性EMSA都不能鑒定出與探針結合的蛋白。在反應體系中加入特定的蛋白抗體，抗體與蛋白-探針復合物結合，抗體-蛋白-探針復合物的電泳遷移變慢，因此，可以確定探針是否與特定的蛋白結合。 附：蛋白DNA結合緩沖液配方（5X） |
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