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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 微生物 » 實驗/技術 » 解救你的細胞污染
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北京艾柏森鐵蟲 (小有名氣)
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[交流]
解救你的細胞污染
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我們在進行細胞實驗時，或多或少都經(jīng)歷過細胞污染的情況，一旦出現(xiàn)細胞污染的情況，全部細胞扔掉難免覺得可惜，之前花的時間、精力也全部打了水漂。 硬著頭皮接著往下做，做出的結果也缺乏說服力，還可能使污染情況更加嚴重。 細胞污染情況復雜，通常認為的細胞污染都是微生物污染。但是凡混入細胞培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物都應視為污染。 細胞污染不能完全被消除，但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴重性。細胞污染根據(jù)污染源主要可以分為物理性，化學性和生物性污染 一、物理性污染的來源、危害及預防 物理性污染常常被人們所忽視或被籠統(tǒng)地歸為化學性污染。物理性污染通過影響細胞培養(yǎng)體系中的生化成分，從而影響細胞的代謝。培養(yǎng)環(huán)境中的物理因素，如溫度、放射線、振動、輻射(紫外線或熒光)會對細胞產(chǎn)生影響。 細胞、培養(yǎng)液或其它培養(yǎng)試劑暴露于放射線、輻射或過冷過熱的溫度中，可以引起細胞代謝發(fā)生改變，如細胞同步化、細胞生長受抑制甚至細胞死亡。 細胞培養(yǎng)箱應放在溫度較恒定的環(huán)境中，周圍不能放置能引起機械振動的設備，如離心機等。培養(yǎng)液從冰箱中取出后應在室溫中放置一段時間后再進行實驗，以避免過冷的溫度對細胞的影響。 二、化學性污染的來源、危害及預防 培養(yǎng)環(huán)境中許多化學物質都可以引起細胞的污染�；瘜W物質并不總是抑制細胞的生長，某些化學物質如激素就可促進細胞的生長。不同細胞對化學物質污染的反應是不一樣的。 未純化的物質、試劑、水、血清、生長輔助因子及儲存試劑的容器都可能成為化學性污染的來源。細胞培養(yǎng)的必需養(yǎng)分若濃度超過了合適的范圍，也會對細胞產(chǎn)生毒性。 同樣，不同細胞系其最佳培養(yǎng)條件下對血清和緩沖液的要求是不一樣的，在培養(yǎng)中應嚴格控制。 動物血清是細胞培養(yǎng)中常用的天然培養(yǎng)基，但血清又是潛在的生物及化學污染的來源。由于血清采集于多個動物，而且不同廠商的生產(chǎn)工藝及質量各不相同，因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。 血清對不同細胞的促生長能力及毒副作用取決于這些細胞的分化功能、組織來源及培養(yǎng)基的成分等因素。在進行一系列實驗時，為了保證實驗的可重復性，最好選用同一批次的血清。 培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑都可能成為化學性污染的來源。 三、微生物污染 由于體外培養(yǎng)的細胞自身沒有抵抗污染的能力，而在培養(yǎng)基中加抗生素的抗污染能力也是有限的，因而細胞微生物污染一旦發(fā)生往往是無法挽救的。 一般在細胞受到污染早期或污染較輕時，能及時處理并除去污染物，部分細胞還有可能得到挽救。但當細胞持續(xù)在污染環(huán)境中生長時，輕者細胞生長緩慢；較重的細胞增殖停止，細胞質中出現(xiàn)大量堆積物，細胞變圓或崩解，從瓶壁脫落。 不同的微生物污染物對細胞的影響也有差別，微生物中支原體和病毒對細胞形態(tài)和技能的影響是長期的，緩慢的和潛在的。而霉菌和細菌增殖迅速，能在很短的時間內(nèi)抑制細胞生長或產(chǎn)生有毒物質殺滅細胞。 芽孢桿菌、葡萄球菌是細菌污染的主要菌屬，污染的主要特征為培養(yǎng)基變黃、渾濁，低倍鏡下呈沙粒狀布滿細胞間隙或培養(yǎng)基，高倍鏡下可見桿狀或球狀的細菌在培養(yǎng)基中游動。 常見的真菌污染是白色念珠菌污染，污染后培養(yǎng)基無明顯渾濁和變色，鏡下可見排列成串珠狀的球形真菌，污染嚴重時可見念珠菌連成片狀或團狀。真菌的運動能力較弱，鏡下一般看不到運動。 霉菌污染時培養(yǎng)基一般也不變渾濁，顏色變化也不明顯，但肉眼可見漂浮的白色菌落，顯微鏡下可看到樹枝狀的菌絲。 支原體在鏡下無法看到，因而支原體污染時只能看到細胞狀態(tài)明顯變差卻沒有其他微生物污染的跡象，此時可通過PCR檢測確定。 還有一種被稱之為“黑膠蟲"的污染，在顯微鏡下觀察呈一粒一粒小黑點，成布朗運動，會阻礙細胞正常生長，對于這個說法眾說紛紜，有人說其就是細胞碎片（并不是它影響了細胞狀態(tài)，而是細胞狀態(tài)發(fā)生變化出現(xiàn)了黑膠蟲增多）；有人說這是玻璃培養(yǎng)瓶中的硅顆粒；有人認為這是支原體污染（可穿過濾膜，可空氣傳播）；有認為是真菌污染的；也有說是寄生類原蟲污染的…… 但也沒有一個明確的研究能夠證實這種情況，眾多的研究只是在驗證這些猜想，現(xiàn)在也沒有一個明確的說法。 那么 如何急救呢？ 01 判斷污染源 一旦發(fā)現(xiàn)細胞有污染的跡象或已污染，需要立即對污染源進行判斷：有無操作不當？培養(yǎng)基、胰酶、PBS等顏色、澄清度是否正常？ 02 及時處理 若確定現(xiàn)有的培養(yǎng)基、胰酶、PBS可用，則繼續(xù)使用；若無法確定則新配完全培養(yǎng)基、PBS、胰酶，原有的液體在確定是否污染后再做處理。 以貼壁細胞為例 對細菌污染細胞進行急救： 1 立即棄去培養(yǎng)容器內(nèi)的培養(yǎng)基，以PBS潤洗2~3次，加入胰酶處理至細胞形態(tài)略有改變但未脫離容器時棄去胰酶，加入PBS輕輕潤洗1遍； 2 加入20×雙抗，浸泡細胞3~5min，棄去雙抗； 3 加入新鮮的完全培養(yǎng)基（含10×雙抗）培養(yǎng)12h； 4 12h棄去培養(yǎng)基以PBS潤洗2~3遍后加入完全培養(yǎng)基（含10×雙抗）； 5 傳代時以較小轉速離心（如平時以1000r/min離心，則可降為800~900r/min離心），仍以含10×雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)； 6 若第二代后鏡下找不到細菌，則第三代起可正常培養(yǎng)。正常培養(yǎng)48h后無反彈則可認為污染已清除。 若為霉菌污染，在以PBS潤洗2~3遍后換液，無需加入高濃度雙抗。培養(yǎng)48h后污染未再次出現(xiàn)即可。 若為真菌污染，在PBS潤洗、換液后可加入兩性霉素B（兩性霉素B有細胞毒性，不推薦使用），也可加入300μg/mL氟康唑培養(yǎng)，污染控制后改用150μg/mL培養(yǎng)2~3代。 若懷疑支原體污染，則可進行PCR檢測或直接使用支原體清除試劑。也可購買環(huán)丙沙星注射液，于超凈臺內(nèi)打開直接添加到培養(yǎng)基中，以20μg/mL濃度2代后改用10μg/mL濃度持續(xù)培養(yǎng)約2周。 當然，最優(yōu)解的方案還是復蘇更換新的細胞進行實驗。最后祝愿大家都能培養(yǎng)健康正常的細胞 |
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