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Treg細胞常用的分子標記與檢測方案--北京百奧思科生物分享
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TEL:137-1827-9886 01 Treg細胞概述 天然CD4+ CD25+ 調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)是一類具有免疫抑制作用的T細胞，約占外周血單個核細胞（PBMC）2%～5%，約占外周CD4+T細胞的5～10%。該類細胞以“主動”的方式參與免疫應答/免疫耐受的調(diào)控，不僅參與自身免疫耐受調(diào)節(jié)，而且在腫瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。 02 Treg細胞的常用的分子標記 抗原分子 表達及其功能 CD4+ 與MHC II類分子結合；主要表達在Th細胞上 CD25+ 表達于大部分Treg細胞上 CD3+ 表達于所有T細胞上，是TCR的組成部分 GITR 陰性標記分子 CTLA-4 結合CD80/CD86 CCR7 介導Treg細胞的遷移 FOXP3 是Treg細胞發(fā)育成熟和發(fā)揮功能的必要因素；是目前Treg細胞最敏感的標記 CD127 CD127是IL-7受體一部分，是新發(fā)現(xiàn)的Treg細胞標記分子 ①CD25：研究表明，多種T細胞分子抗原可以參與Treg細胞的特異性功能效應。傳統(tǒng)鑒定Treg細胞主要是通過CD4和CD25來標記。但這種方式并不完全準確。 ②FOXP3：目前，F(xiàn)oxp3(forkhead box P3，Scurfin)是目前公認的Treg細胞的最敏感的標志。 它的表達及功能與調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，TR細胞)密切相關。 ③CD127：最近發(fā)現(xiàn)通過表達CD4，CD25和傳導信號FoxP3來定義調(diào)節(jié)性T細胞時，在一類特殊的細胞群體時會出現(xiàn)問題。IL-7受體（CD127）在外周血CD4+T的一個亞群中會下調(diào)表達。我們證實這些細胞FoxP3陽性，且這群細胞包括那些CD25弱陽性或陰性群體。聯(lián)CD4，CD25和CD127的聯(lián)合使用可得到高純度的調(diào)節(jié)性T細胞，比以前的通過其他標志物來區(qū)分方法顯著提高。 03 FOXP3流式檢測方法 （1）實驗材料 實驗設備 流式上樣管 混勻振蕩器 離心機 移液器、Tips 流式細胞儀 所需試劑 細胞表面染色的熒光標記的單抗試劑（CD4、CD25或CD8等） FOXP3熒光標記抗體 溶血素：（eBioscience目錄號00-4333）用于裂解紅細胞 淋巴細胞分離液：若樣品為人的全血，建議先用分離液分離出單個核細胞后再做后續(xù)檢測 固定劑和破膜劑：（eBioscience FOXP3檢測專用試劑，目錄號為00-5521或00-5523；在FOXP3染色前，將其中的Fixation/Permeabilization Concentrate和Fixation/Permeabilization Diluent以1：3的比例混合，配制好的溶液保存時間不要超過一天） 其他試劑：Flow Cytometry Staining Buffer（00-4222）或PBS，Permeabilization Buffer（Cat.No 00-8333）等 （2）實驗操作步驟 按照流式樣品要求制備單細胞懸液。 按照流式表面染色方法標記CD3和CD4。緩沖液洗滌一次，離心完全棄上清。斡旋分散細胞。 加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定細胞。室溫或四度避光孵育30-60min（小鼠樣品最長可以四度固定18小時）。 每管加2ml 1×permeabilization buffer。 300g 室溫離心5min,棄上清。 2ml 1×permeabilization buffer重懸細胞。 300g 室溫離心5min,棄上清。 加100ul 1×permeabilization buffer 重懸細胞后，加入二抗FOXP3 （或其他胞內(nèi)抗原抗體），室溫避光孵育20min。 2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室溫離心5min,棄上清。 加2ml 流式染色液，300g 室溫離心5min,棄上清。 適量流式染色液重懸，即可上機檢測。同行對照依照上述步驟進行。軟件分析結果。 注：在染胞內(nèi)或胞核內(nèi)的因子時，要對細胞進行固定和破膜，因此，與活細胞相比，在形態(tài)上會有一定變化，因此必須對所有細胞樣本進行固定和破膜；若對Blank和染色細胞沒做固定和破膜，在FSC/SSC圖中對固定和破膜的樣品細胞圈門時需要做一定調(diào)整。 |
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