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Treg細(xì)胞常用的分子標(biāo)記與檢測方案--北京百奧思科生物分享
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TEL:137-1827-9886 01 Treg細(xì)胞概述 天然CD4+ CD25+ 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)是一類具有免疫抑制作用的T細(xì)胞，約占外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）2%～5%，約占外周CD4+T細(xì)胞的5～10%。該類細(xì)胞以“主動(dòng)”的方式參與免疫應(yīng)答/免疫耐受的調(diào)控，不僅參與自身免疫耐受調(diào)節(jié)，而且在腫瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。 02 Treg細(xì)胞的常用的分子標(biāo)記 抗原分子 表達(dá)及其功能 CD4+ 與MHC II類分子結(jié)合；主要表達(dá)在Th細(xì)胞上 CD25+ 表達(dá)于大部分Treg細(xì)胞上 CD3+ 表達(dá)于所有T細(xì)胞上，是TCR的組成部分 GITR 陰性標(biāo)記分子 CTLA-4 結(jié)合CD80/CD86 CCR7 介導(dǎo)Treg細(xì)胞的遷移 FOXP3 是Treg細(xì)胞發(fā)育成熟和發(fā)揮功能的必要因素；是目前Treg細(xì)胞最敏感的標(biāo)記 CD127 CD127是IL-7受體一部分，是新發(fā)現(xiàn)的Treg細(xì)胞標(biāo)記分子 ①CD25：研究表明，多種T細(xì)胞分子抗原可以參與Treg細(xì)胞的特異性功能效應(yīng)。傳統(tǒng)鑒定Treg細(xì)胞主要是通過CD4和CD25來標(biāo)記。但這種方式并不完全準(zhǔn)確。 ②FOXP3：目前，F(xiàn)oxp3(forkhead box P3，Scurfin)是目前公認(rèn)的Treg細(xì)胞的最敏感的標(biāo)志。 它的表達(dá)及功能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，TR細(xì)胞)密切相關(guān)。 ③CD127：最近發(fā)現(xiàn)通過表達(dá)CD4，CD25和傳導(dǎo)信號(hào)FoxP3來定義調(diào)節(jié)性T細(xì)胞時(shí)，在一類特殊的細(xì)胞群體時(shí)會(huì)出現(xiàn)問題。IL-7受體（CD127）在外周血CD4+T的一個(gè)亞群中會(huì)下調(diào)表達(dá)。我們證實(shí)這些細(xì)胞FoxP3陽性，且這群細(xì)胞包括那些CD25弱陽性或陰性群體。聯(lián)CD4，CD25和CD127的聯(lián)合使用可得到高純度的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，比以前的通過其他標(biāo)志物來區(qū)分方法顯著提高。 03 FOXP3流式檢測方法 （1）實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 流式上樣管 混勻振蕩器 離心機(jī) 移液器、Tips 流式細(xì)胞儀 所需試劑 細(xì)胞表面染色的熒光標(biāo)記的單抗試劑（CD4、CD25或CD8等） FOXP3熒光標(biāo)記抗體 溶血素：（eBioscience目錄號(hào)00-4333）用于裂解紅細(xì)胞 淋巴細(xì)胞分離液：若樣品為人的全血，建議先用分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞后再做后續(xù)檢測 固定劑和破膜劑：（eBioscience FOXP3檢測專用試劑，目錄號(hào)為00-5521或00-5523；在FOXP3染色前，將其中的Fixation/Permeabilization Concentrate和Fixation/Permeabilization Diluent以1：3的比例混合，配制好的溶液保存時(shí)間不要超過一天） 其他試劑：Flow Cytometry Staining Buffer（00-4222）或PBS，Permeabilization Buffer（Cat.No 00-8333）等 （2）實(shí)驗(yàn)操作步驟 按照流式樣品要求制備單細(xì)胞懸液。 按照流式表面染色方法標(biāo)記CD3和CD4。緩沖液洗滌一次，離心完全棄上清。斡旋分散細(xì)胞。 加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定細(xì)胞。室溫或四度避光孵育30-60min（小鼠樣品最長可以四度固定18小時(shí)）。 每管加2ml 1×permeabilization buffer。 300g 室溫離心5min,棄上清。 2ml 1×permeabilization buffer重懸細(xì)胞。 300g 室溫離心5min,棄上清。 加100ul 1×permeabilization buffer 重懸細(xì)胞后，加入二抗FOXP3 （或其他胞內(nèi)抗原抗體），室溫避光孵育20min。 2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室溫離心5min,棄上清。 加2ml 流式染色液，300g 室溫離心5min,棄上清。 適量流式染色液重懸，即可上機(jī)檢測。同行對(duì)照依照上述步驟進(jìn)行。軟件分析結(jié)果。 注：在染胞內(nèi)或胞核內(nèi)的因子時(shí)，要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定和破膜，因此，與活細(xì)胞相比，在形態(tài)上會(huì)有一定變化，因此必須對(duì)所有細(xì)胞樣本進(jìn)行固定和破膜；若對(duì)Blank和染色細(xì)胞沒做固定和破膜，在FSC/SSC圖中對(duì)固定和破膜的樣品細(xì)胞圈門時(shí)需要做一定調(diào)整。 |
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