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細菌相關(guān)研究文獻分享,輕松讀完一篇文獻（一）: 領取紅包 (小木蟲手機app專屬紅包)

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今天分享一篇發(fā)表在Talanta（2020年IF=5.339）上的文章，名為《Rapid quantification of pathogenic Salmonella Typhimurium and total bacteria in eggs by nano-flow cytometry》[1]（利用納米流式檢測技術(shù)快速定量雞蛋中致病性鼠傷寒沙門氏菌和總細菌）。

雞蛋是自然界中最有營養(yǎng)和最經(jīng)濟的食物之一。然而，食用生蛋或未煮熟的蛋或處理不當?shù)牡盎虻爸破放c食源性疾病的爆發(fā)密切相關(guān)。美國食品和藥物管理局(FDA)估計，每年有79000例食源性疾病和30例死亡是由食用被沙門氏菌污染的雞蛋引起的。僅在美國，每年生產(chǎn)的大約320萬只雞蛋受到腸炎沙門氏菌的污染，造成巨大的經(jīng)濟損失。這主要是由于雞蛋在生產(chǎn)、運輸、儲存和銷售過程中極易受到細菌污染。到目前為止，雞蛋相關(guān)的疫情大多是由致病性沙門氏菌引起的，特別是鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)和腸炎沙門氏菌。另一方面，雖然被非致病菌污染的雞蛋一般不會直接導致人類疾病，但雞蛋的營養(yǎng)價值和保質(zhì)期會降低，從而造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，為保證雞蛋微生物的安全性和質(zhì)量，雞蛋中特定致病菌株和總細菌同時定量是非常重要的。

傳統(tǒng)的培養(yǎng)依賴平板計數(shù)法是食品工業(yè)細菌負荷定量的標準方法，但該方法勞動強度大，耗時長，且難以檢測活的但不可培養(yǎng)的(VBNC)細菌。另外，在食品樣本中培養(yǎng)特定的致病菌株需要選擇性電鍍、預富集、選擇性富集和鑒定，通常需要數(shù)天的時間才能得到結(jié)果�？焖贆z測食品中的細菌病原體對于減輕食源性疾病的暴發(fā)至關(guān)重要，因為可以快速識別被污染的食品，防止疾病的進一步傳播。為此，一些不需要培養(yǎng)的核酸方法，如聚合酶鏈反應(PCR)已被用于檢測病原體。然而，食品樣品成分對PCR的抑制會降低擴增效率。此外，擴增時間仍較長，需注意避免污染。雖然不經(jīng)過培養(yǎng)的快速細菌定量對雞蛋的要求很高，有兩個主要障礙需要克服。首先，蛋黃的微、納米結(jié)構(gòu)成分，如含有低密度脂蛋白(LDL, 17-60 nm)的顆粒(非可溶性蛋白聚集物，0.3-2 μm)和血漿，以及所有蛋黃成分形成的油滴，可以粘附細菌或結(jié)合染色分子，從而影響定量的準確性。其次，雞蛋中的細菌數(shù)量較少。因此，樣品前處理的效率和檢測技術(shù)的靈敏度是雞蛋細菌污染檢測的關(guān)鍵。為了避免卵基質(zhì)成分的干擾，避開耗時的培養(yǎng)過程，Vinayaka等采用免疫磁珠捕獲細菌，再結(jié)合PCR檢測無培養(yǎng)富集的鼠傷寒沙門氏菌。Zeinhom等人開發(fā)了一種基于免疫磁珠和熒光標記抗體的三明治免疫傳感器，然后結(jié)合便攜式智能手機設備檢測大腸桿菌O157:H7。然而，目前尚缺乏特異性病原菌和總細菌同時定量的方法。

流式細胞術(shù)(FCM)已被證明能有效定量特異性病原菌和總細菌。特別是流式細胞術(shù)通過提供單細胞的高通量、定量和多參數(shù)分析，在微生物學研究和診斷中越來越受歡迎。例如，Mcclelland等人使用牛奶澄清溶液分散雞蛋中的油滴，然后使用溴化乙錠核酸染色結(jié)合熒光標記抗體，通過實驗室構(gòu)建的流式細胞儀檢測雞蛋中的鼠傷寒桿菌。然而，他們的流式細胞儀很難從背景信號中區(qū)分細菌細胞，而且已經(jīng)證明使用清乳液很難徹底去除雞蛋中的蛋白質(zhì)和脂肪聚集體。

利用實驗室建造的納米流式細胞儀(nFCM)，其靈敏度是傳統(tǒng)流式細胞儀的數(shù)百倍，在這里，我們報道了一種快速和靈敏的方法，用于不需要培養(yǎng)的雞蛋中致病性鼠傷寒桿菌和總細菌的定量。以添加鼠傷寒沙門氏菌和無害大腸桿菌K12 (E. coli K12)的雞蛋為模型，對樣品預處理方案進行優(yōu)化。采用實驗室構(gòu)建的nFCM對單個細菌發(fā)出的同時側(cè)散射、綠色熒光和紅色熒光信號進行分析，SYTO 62核酸染色和免疫熒光標記Alexa Fluor 488 (AF488)偶聯(lián)的抗鼠傷寒桿菌單克隆抗體(mAb)。對該方法的細菌回收率、檢出限和特異性進行了研究。

研究過程：

一、材料略

二、細菌的生長和收獲

鼠傷寒桿菌和大腸桿菌K12在LB肉湯中培養(yǎng)過夜，在600nm下，光密度為1.0 (OD600，由可見分光光度計檢測）。5000g離心5min, PBS洗滌3次。除非另有說明，將洗過的細菌細胞重懸在PBS中，并調(diào)整到OD600為0.1(約1 ×10^8 cfu/ml)。收獲的鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌K12細胞保存在4℃，用于后續(xù)實驗。所有致病菌實驗均按照致病菌實驗室通用生物安全標準(WS 233-2017)進行。

三、雞蛋樣品的預處理

從當?shù)爻匈徺I的新鮮帶殼雞蛋，用無菌水清洗，并用75%乙醇擦洗，去除蛋殼上的細菌。在無菌條件下打破雞蛋，將蛋液收集到一個無菌折邊搖瓶中。將收集到的蛋液放在軌道搖床培養(yǎng)箱上，在4℃下以250 rpm的速度搖10分鐘。然后取100 μL液體移入1.5 mL eppendorf管中，加入630 μL PBS、200 μL Triton X-100(10%)和70 μL蛋白酶K (20 mg/mL)。將試管旋轉(zhuǎn)攪拌均勻，然后在37℃下孵育20分鐘，消化蛋白質(zhì)和溶解脂肪。通過PP膜(5 μm孔徑)過濾消化后的蛋液，去除未完全消化/溶解的殘留顆粒。過濾后的蛋液5000 g離心5 min。小心取出900ul上清，加入900 μL PBS混勻。再次以5000 g離心5 min，小心取出900 μL上清，用100 μL的殘留上清重懸顆粒。

四、添加細菌的雞蛋樣品的制備

取1ml收獲的鼠傷寒桿菌、大腸桿菌K12或不同比例的鼠傷寒桿菌和大腸桿菌K12細胞的混合物，在5000 g下離心5分鐘，然后在1ml蛋液中重懸。然后將100 μL加菌蛋液移入1.5 mL eppendorf管中。當樣品量增加到1.0 mL時，取1.0 mL加入細菌的蛋液加入15ml的eppendorf管中，加入6.3 mL PBS, 2ml Triton X-100(10%)和700 μl蛋白酶K (20 mg/mL)。將試管旋轉(zhuǎn)攪拌均勻，然后在37℃下孵育20分鐘，以消化蛋白質(zhì)和溶解脂肪。通過PP膜(5μm孔徑)過濾消化后的蛋液，去除未完全消化/溶解的殘留顆粒。將過濾后的液蛋在5000 g下離心5 min，小心取出9ml上清液，將殘留的1ml溶液移至1.5 mL eppendorf管中。5000 g離心洗滌2次，5 min，小心取出900 μL上清，用100 μL的殘留上清重懸顆粒。

五、雞蛋樣品中細菌的熒光染色

將1 μL SYTO 62 (500 μM)加入50 μL雞蛋液中，混合均勻，對雞蛋樣品中的細菌進行核酸染色。染色樣品在nFCM分析前在室溫黑暗中保存10分鐘。對細菌進行雙熒光染色，將1 μL AF488偶聯(lián)的抗鼠傷寒桿菌單抗(500 μg/mL)加入50 μL制備的液蛋中，37°C避光孵育30 min。注意免疫熒光染色時未進行洗滌。然后，加入1 μL SYTO 62 (500 μM)，室溫孵育10 min后，用nFCM進行分析。每次實驗都以未添加細菌的雞蛋樣本作為陰性對照。

六、細菌平板計數(shù)

100ul添加了大腸桿菌k12的雞蛋樣品的十倍稀釋液直接鋪在LB瓊脂上，重復3次。培養(yǎng)皿在37°C下孵育24小時。

七、納米流式檢測

nFCM配備了三個光電倍增管(PMTs)，用于同時檢測側(cè)散射(SS)和兩個熒光(FL)通道(圖S1a)。用200mw 488 nm連續(xù)波激光器(Sapphire 488 LP, Coherent, USA)衰減到20mw作為激光源。用顯微鏡物鏡(CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 40XC，尼康，日本)垂直于激光束和樣品流收集單個細菌發(fā)出的光。然后用兩個二色分光器(FF500-Di01和FF605-Di02, Semrock)將光定向到3個光路，用于同時檢測SS、綠色FL (FF01?520/35,LP01-488RU, Semrock)和紅色FL (FB70040, Thorlabs)。每個通道使用一個光電倍增管(PMT, R928，濱松，日本)。除非另有說明，每個樣本都進行了60秒的數(shù)據(jù)采集。采用直徑為200±9 nm的熒光球(Invitrogen, CA, USA)來校準細菌計數(shù)的樣品流速。AF488和SYTO 62的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜以及兩個帶通濾波器的透射范圍如圖S1b所示。在nFCM裝置中，使用10 mm焦距的消色差雙透鏡將0.7 mm直徑的激光輸出光束聚焦到~9 μm直徑的光斑(1/e2)上，聚焦到~4 μm的樣品流上。因此，樣品流在聚焦激光束中心被完全照亮，檢測效率接近100%。通過樣品流和激光束的重疊，檢測體積為~0.11 pL。根據(jù)泊松分布，對于濃度為10^8個細胞/mL的細菌樣本，計算出兩種細菌同時駐留在檢測體積中的概率小于0.006%。

結(jié)果展示：

結(jié)果就展示這么多，有興趣的話可以自己找這篇文獻具體看，或者私聊我要文獻資料，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻：

[1]Mao, C; Xue, C; Wang, X; et al.Rapid quantification of pathogenic Salmonella Typhimurium and total bacteria in eggs by nano-flow cytometry.[J].Talanta.2020,217():121020

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