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今天分享一篇發(fā)表在Talanta(2020年IF=5.339)上的文章,名為《Rapid quantification of pathogenic Salmonella Typhimurium and total bacteria in eggs by nano-flow cytometry》[1]( 利用納米流式檢測技術(shù)快速定量雞蛋中致病性鼠傷寒沙門氏菌和總細(xì)菌)。

雞蛋是自然界中最有營養(yǎng)和最經(jīng)濟(jì)的食物之一。然而,食用生蛋或未煮熟的蛋或處理不當(dāng)?shù)牡盎虻爸破放c食源性疾病的爆發(fā)密切相關(guān)。美國食品和藥物管理局(FDA)估計,每年有79000例食源性疾病和30例死亡是由食用被沙門氏菌污染的雞蛋引起的。僅在美國,每年生產(chǎn)的大約320萬只雞蛋受到腸炎沙門氏菌的污染,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。這主要是由于雞蛋在生產(chǎn)、運輸、儲存和銷售過程中極易受到細(xì)菌污染。到目前為止,雞蛋相關(guān)的疫情大多是由致病性沙門氏菌引起的,特別是鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)和腸炎沙門氏菌。另一方面,雖然被非致病菌污染的雞蛋一般不會直接導(dǎo)致人類疾病,但雞蛋的營養(yǎng)價值和保質(zhì)期會降低,從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,為保證雞蛋微生物的安全性和質(zhì)量,雞蛋中特定致病菌株和總細(xì)菌同時定量是非常重要的。

傳統(tǒng)的培養(yǎng)依賴平板計數(shù)法是食品工業(yè)細(xì)菌負(fù)荷定量的標(biāo)準(zhǔn)方法,但該方法勞動強度大,耗時長,且難以檢測活的但不可培養(yǎng)的(VBNC)細(xì)菌。另外,在食品樣本中培養(yǎng)特定的致病菌株需要選擇性電鍍、預(yù)富集、選擇性富集和鑒定,通常需要數(shù)天的時間才能得到結(jié)果?焖贆z測食品中的細(xì)菌病原體對于減輕食源性疾病的暴發(fā)至關(guān)重要,因為可以快速識別被污染的食品,防止疾病的進(jìn)一步傳播。為此,一些不需要培養(yǎng)的核酸方法,如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)已被用于檢測病原體。然而,食品樣品成分對PCR的抑制會降低擴(kuò)增效率。此外,擴(kuò)增時間仍較長,需注意避免污染。雖然不經(jīng)過培養(yǎng)的快速細(xì)菌定量對雞蛋的要求很高,有兩個主要障礙需要克服。首先,蛋黃的微、納米結(jié)構(gòu)成分,如含有低密度脂蛋白(LDL, 17-60 nm)的顆粒(非可溶性蛋白聚集物,0.3-2 μm)和血漿,以及所有蛋黃成分形成的油滴,可以粘附細(xì)菌或結(jié)合染色分子,從而影響定量的準(zhǔn)確性。其次,雞蛋中的細(xì)菌數(shù)量較少。因此,樣品前處理的效率和檢測技術(shù)的靈敏度是雞蛋細(xì)菌污染檢測的關(guān)鍵。為了避免卵基質(zhì)成分的干擾,避開耗時的培養(yǎng)過程,Vinayaka等采用免疫磁珠捕獲細(xì)菌,再結(jié)合PCR檢測無培養(yǎng)富集的鼠傷寒沙門氏菌。Zeinhom等人開發(fā)了一種基于免疫磁珠和熒光標(biāo)記抗體的三明治免疫傳感器,然后結(jié)合便攜式智能手機(jī)設(shè)備檢測大腸桿菌O157:H7。然而,目前尚缺乏特異性病原菌和總細(xì)菌同時定量的方法。

流式細(xì)胞術(shù)(FCM)已被證明能有效定量特異性病原菌和總細(xì)菌。特別是流式細(xì)胞術(shù)通過提供單細(xì)胞的高通量、定量和多參數(shù)分析,在微生物學(xué)研究和診斷中越來越受歡迎。例如,Mcclelland等人使用牛奶澄清溶液分散雞蛋中的油滴,然后使用溴化乙錠核酸染色結(jié)合熒光標(biāo)記抗體,通過實驗室構(gòu)建的流式細(xì)胞儀檢測雞蛋中的鼠傷寒桿菌。然而,他們的流式細(xì)胞儀很難從背景信號中區(qū)分細(xì)菌細(xì)胞,而且已經(jīng)證明使用清乳液很難徹底去除雞蛋中的蛋白質(zhì)和脂肪聚集體。

利用實驗室建造的納米流式細(xì)胞儀(nFCM),其靈敏度是傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的數(shù)百倍,在這里,我們報道了一種快速和靈敏的方法,用于不需要培養(yǎng)的雞蛋中致病性鼠傷寒桿菌和總細(xì)菌的定量。以添加鼠傷寒沙門氏菌和無害大腸桿菌K12 (E. coli K12)的雞蛋為模型,對樣品預(yù)處理方案進(jìn)行優(yōu)化。采用實驗室構(gòu)建的nFCM對單個細(xì)菌發(fā)出的同時側(cè)散射、綠色熒光和紅色熒光信號進(jìn)行分析,SYTO 62核酸染色和免疫熒光標(biāo)記Alexa Fluor 488 (AF488)偶聯(lián)的抗鼠傷寒桿菌單克隆抗體(mAb)。對該方法的細(xì)菌回收率、檢出限和特異性進(jìn)行了研究。

研究過程:

一、材料略

二、細(xì)菌的生長和收獲

鼠傷寒桿菌和大腸桿菌K12在LB肉湯中培養(yǎng)過夜,在600nm下,光密度為1.0 (OD600,由可見分光光度計檢測)。5000g離心5min, PBS洗滌3次。除非另有說明,將洗過的細(xì)菌細(xì)胞重懸在PBS中,并調(diào)整到OD600為0.1(約1 ×10^8 cfu/ml)。收獲的鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌K12細(xì)胞保存在4℃,用于后續(xù)實驗。所有致病菌實驗均按照致病菌實驗室通用生物安全標(biāo)準(zhǔn)(WS 233-2017)進(jìn)行。

三、 雞蛋樣品的預(yù)處理

從當(dāng)?shù)爻匈徺I的新鮮帶殼雞蛋,用無菌水清洗,并用75%乙醇擦洗,去除蛋殼上的細(xì)菌。在無菌條件下打破雞蛋,將蛋液收集到一個無菌折邊搖瓶中。將收集到的蛋液放在軌道搖床培養(yǎng)箱上,在4℃下以250 rpm的速度搖10分鐘。然后取100 μL液體移入1.5 mL eppendorf管中,加入630 μL PBS、200 μL Triton X-100(10%)和70 μL蛋白酶K (20 mg/mL)。將試管旋轉(zhuǎn)攪拌均勻,然后在37℃下孵育20分鐘,消化蛋白質(zhì)和溶解脂肪。通過PP膜(5 μm孔徑)過濾消化后的蛋液,去除未完全消化/溶解的殘留顆粒。過濾后的蛋液5000 g離心5 min。小心取出900ul上清,加入900 μL PBS混勻。再次以5000 g離心5 min,小心取出900 μL上清,用100 μL的殘留上清重懸顆粒。

四、添加細(xì)菌的雞蛋樣品的制備

取1ml收獲的鼠傷寒桿菌、大腸桿菌K12或不同比例的鼠傷寒桿菌和大腸桿菌K12細(xì)胞的混合物,在5000 g下離心5分鐘,然后在1ml蛋液中重懸。然后將100 μL加菌蛋液移入1.5 mL eppendorf管中。當(dāng)樣品量增加到1.0 mL時,取1.0 mL加入細(xì)菌的蛋液加入15ml的eppendorf管中,加入6.3 mL PBS, 2ml Triton X-100(10%)和700 μl蛋白酶K (20 mg/mL)。將試管旋轉(zhuǎn)攪拌均勻,然后在37℃下孵育20分鐘,以消化蛋白質(zhì)和溶解脂肪。通過PP膜(5μm孔徑)過濾消化后的蛋液,去除未完全消化/溶解的殘留顆粒。將過濾后的液蛋在5000 g下離心5 min,小心取出9ml上清液,將殘留的1ml溶液移至1.5 mL eppendorf管中。5000 g離心洗滌2次,5 min,小心取出900 μL上清,用100 μL的殘留上清重懸顆粒。

五、 雞蛋樣品中細(xì)菌的熒光染色

將1 μL SYTO 62 (500 μM)加入50 μL雞蛋液中,混合均勻,對雞蛋樣品中的細(xì)菌進(jìn)行核酸染色。染色樣品在nFCM分析前在室溫黑暗中保存10分鐘。對細(xì)菌進(jìn)行雙熒光染色,將1 μL AF488偶聯(lián)的抗鼠傷寒桿菌單抗(500 μg/mL)加入50 μL制備的液蛋中,37°C避光孵育30 min。注意免疫熒光染色時未進(jìn)行洗滌。然后,加入1 μL SYTO 62 (500 μM),室溫孵育10 min后,用nFCM進(jìn)行分析。每次實驗都以未添加細(xì)菌的雞蛋樣本作為陰性對照。

六、細(xì)菌平板計數(shù)

100ul添加了大腸桿菌k12的雞蛋樣品的十倍稀釋液直接鋪在LB瓊脂上,重復(fù)3次。培養(yǎng)皿在37°C下孵育24小時。

七、納米流式檢測

nFCM配備了三個光電倍增管(PMTs),用于同時檢測側(cè)散射(SS)和兩個熒光(FL)通道(圖S1a)。用200mw 488 nm連續(xù)波激光器(Sapphire 488 LP, Coherent, USA)衰減到20mw作為激光源。用顯微鏡物鏡(CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 40XC,尼康,日本)垂直于激光束和樣品流收集單個細(xì)菌發(fā)出的光。然后用兩個二色分光器(FF500-Di01和FF605-Di02, Semrock)將光定向到3個光路,用于同時檢測SS、綠色FL (FF01?520/35,LP01-488RU, Semrock)和紅色FL (FB70040, Thorlabs)。每個通道使用一個光電倍增管(PMT, R928,濱松,日本)。除非另有說明,每個樣本都進(jìn)行了60秒的數(shù)據(jù)采集。采用直徑為200±9 nm的熒光球(Invitrogen, CA, USA)來校準(zhǔn)細(xì)菌計數(shù)的樣品流速。AF488和SYTO 62的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜以及兩個帶通濾波器的透射范圍如圖S1b所示。在nFCM裝置中,使用10 mm焦距的消色差雙透鏡將0.7 mm直徑的激光輸出光束聚焦到~9 μm直徑的光斑(1/e2)上,聚焦到~4 μm的樣品流上。因此,樣品流在聚焦激光束中心被完全照亮,檢測效率接近100%。通過樣品流和激光束的重疊,檢測體積為~0.11 pL。根據(jù)泊松分布,對于濃度為10^8個細(xì)胞/mL的細(xì)菌樣本,計算出兩種細(xì)菌同時駐留在檢測體積中的概率小于0.006%。

結(jié)果展示:

結(jié)果就展示這么多,有興趣的話可以自己找這篇文獻(xiàn)具體看,或者私聊我要文獻(xiàn)資料,有理解得不對的地方,歡迎專業(yè)人士指正,一起交流~

參考文獻(xiàn):

[1]Mao, C; Xue, C; Wang, X; et al.Rapid quantification of pathogenic Salmonella Typhimurium and total bacteria in eggs by nano-flow cytometry.[J].Talanta.2020,217():121020

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