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線粒體相關研究文獻分享,輕松讀完一篇文獻（一）: 領取紅包 (小木蟲手機app專屬紅包)

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今天分享一篇發(fā)表在Talanta（2020年IF=5.339）上的文章，名為《Rapid and quantitative in vitro analysis of mitochondrial fusion and its interplay with apoptosis》[1]（線粒體融合及其與凋亡的相互作用的快速和定量體外分析）。

線粒體是高度動態(tài)的細胞器，不斷地進行融合和分裂。線粒體融合除了通過內容物混合維持基因組的穩(wěn)定性和生理功能，還與細胞凋亡、代謝和自噬有關。線粒體融合缺陷與許多人類疾病有關，如神經退行性疾病、心血管疾病和癌癥。由于線粒體融合缺失導致細胞線粒體網絡碎片化，研究線粒體融合最經典的方法是基于線粒體形態(tài)學的微觀分析。然而，線粒體碎片可能是融合減少或裂變增加的結果，線粒體融合水平不能直接測量。由于線粒體融合和裂變協(xié)同調控線粒體形態(tài)和功能，線粒體融合在細胞凋亡和癌癥進展中的直接作用仍不清楚。因此，對線粒體融合的直接定量測量是研究其在細胞過程和疾病發(fā)病機制中的重要作用以及篩選其調控因子的迫切需要。

線粒體分裂需要將細胞質Drp1(一種裂變必需的動力相關蛋白)募集到線粒體，并與內質網結合。與線粒體分裂不同，線粒體融合不依賴于細胞質蛋白，可以通過線粒體膜內嵌的GTPases來促進。2004年首次報道了線粒體融合的體外研究，通過熒光顯微鏡展示其能量需求和分子水平促進線粒體融合的過程。研究表明，體外融合實驗可以真實再現體內線粒體融合。通過將線粒體與細胞質等亞細胞細胞器分離，可以最大限度地減少裂變等因素的干擾，使數據解釋更加直觀。此外，體外線粒體融合實驗還可以揭示線粒體的內在異質性。線粒體融合的體外分析不僅為了解融合GTPases在調節(jié)線粒體附著和外膜(OM)、內膜(IM)融合中的特定作用提供了重要的視角，而且促進了融合調節(jié)因子的發(fā)現。熒光顯微鏡和電子顯微鏡(EM)是線粒體融合體外分析最常用的方法，但顯微技術是勞動密集型和半定量的，在高通量篩選融合調節(jié)劑方面效率低下。

為了實現鞘流中單分子熒光檢測的策略，我們開發(fā)了納米流式檢測技術(nFCM)，它在側向散射和熒光檢測方面的靈敏度比傳統(tǒng)流式細胞術高出數百倍。利用實驗室構建的納米流式細胞儀(nFCM)在單個線粒體多參數分析方面的卓越靈敏性，我們報道了一種高通量和定量的體外線粒體融合測量方法。將分離的表達綠色熒光蛋白(GFP-mito)和dissoma紅色熒光蛋白(DsRed-mito)的線粒體混合，誘導融合，并用nFCM分析。同時出現綠色和紅色熒光信號的顆粒被確定為異型融合顆粒。為了更好地理解線粒體融合和細胞凋亡之間的相互作用，本研究采用已開發(fā)的方法，研究胞質凋亡通路對線粒體融合的影響，研究融合在細胞凋亡中的直接作用，并確定可以直接調節(jié)線粒體融合的化合物。

研究過程：

一、材料（略）

二、細胞培養(yǎng)和穩(wěn)定轉染

HeLa細胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)。轉染前12-24小時，將HeLa細胞置于12孔培養(yǎng)皿中，每孔2×10^5個細胞。來自Aequorea coerulescens和dissoma sp. red熒光蛋白(DsRed)的人源化GFP分別編碼為pAcGFP1-Mito和pDsRed2-Mito，這兩種蛋白均含有人細胞色素c氧化酶亞基VIII (Mito)的線粒體靶向序列。使用TransLipid HL轉染試劑將編碼GFP1-Mito或DsRed2-Mito的質粒分別轉染到HeLa細胞中。兩種質粒表達48 h后，加入250 ~ 500 μg/mL G418，3 ~ 4周篩選穩(wěn)定表達的細胞。穩(wěn)定轉染的細胞群被擴增，并按照標準方案存儲。

三、線粒體和胞漿提取物的分離

每次實驗，未轉染HeLa細胞或穩(wěn)定表達線粒體靶向熒光蛋白(GFP或DsRed)的細胞在15cm板中培養(yǎng)至90%的融合度。為了制備凋亡細胞液，將未轉染的細胞分別在含有250nM staurosporine的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3和9 h。用胰蛋白酶法收集細胞，并用PBS洗滌。細胞顆粒在800 μL冷線粒體分離試劑A中重懸，用Dounce組織研磨機在冰上研磨60次得到細胞勻漿。將勻漿轉移到一個新管中，加入800 μL冷線粒體分離試劑C并混合。勻漿4度700 g離心10分鐘去除細胞核和完整的細胞，上清重復一次4度700 g離心10分鐘。將上清液轉移到一個新的試管中，12,000 g4度離心15分鐘。上清部分為胞漿富集部分。用BCA法測定線粒體和富細胞質組分的蛋白濃度。將提取物分裝，在液氮中瞬間冷凍，凍干，并在?80度下保存?zhèn)溆谩?br />
四、線粒體體外融合

將含有160 μg總蛋白的分離線粒體混合物用100 μL FB-A重懸，4度16000 g離心濃縮10 min。在去除上清液之前，將濃縮的線粒體顆粒放在冰上孵育至少10分鐘。然后在40 μL FB-B (OM和IM融合過程)或FB-A (OM融合過程)中重懸，第二級融合在37度下進行90分鐘。

五、胞質提取物及化合物對線粒體融合的影響分析

為了分析不同細胞質提取物對線粒體融合的影響，分別在第1階段(離心前添加5 min，第1階段保持)和第2階段，將分離的線粒體重懸在FB-A和FB-B制備的5mg/mL細胞質提取物中。為了分析不同化合物對體外線粒體融合的影響，在第1階段(離心前添加5分鐘，并在第1階段保持)和第2階段(在FB-B重懸時添加)，分離的線粒體在指定濃度下與下列化學物質孵育：白樺脂酸，20、40、60和200 μM；抗霉素A, 200 μM；順鉑200μM。融合樣品以0.3% DMSO(藥物溶劑的最高濃度)孵育作為溶劑對照。

六、線粒體膜電位分析(Δψm)

為了比較融合反應和藥物治療陰性對照之間Δψm的差異，從未轉染HeLa細胞中分離的線粒體在FB或MTB的第1階段和第2階段以指定濃度白樺脂酸處理。然后，測定Δψm，融合樣品和陰性對照在200 μL的500 nM DiOC6(3)中重懸，在37?C下孵育15分鐘，用MTB洗一次，nFCM分析。

七、納米流式檢測

采用納米流式檢測儀(nFCM)，使用488nm激光器(10 mW)和3個檢測通道對單個線粒體進行分析。FL-1通道(520/35nm帶通濾光片)和FL-2通道(660/52nm帶通濾光片)分別檢測GFP的綠色熒光和DsRed的紅色熒光。在側向散射、綠色熒光(FL-1)和紅色熒光(FL-2)通道同時檢測光子爆發(fā)。

八、電子顯微鏡成像（略）

九、熒光成像（略）

十、Western blot檢測分離的胞漿提取物中的Bid和Bax（略）

結果展示：

結果就展示這么多，有興趣的話可以自己找這篇文獻具體看，或者私聊我要文獻資料，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻：

[1]Xu, J; Su, L; Han, J; et al.Rapid and quantitative in vitro analysis of mitochondrial fusion and its interplay with apoptosis.[J].Talanta.2021,222():121523

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