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臨床與分析新蟲 (初入文壇)
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液相學(xué)習(xí)|1|：液相（LC）方法開發(fā)的常規(guī)套路（上） 已有1人參與
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▉ 導(dǎo)讀 您有沒有遭遇過在儀器前折騰了半天，還有出現(xiàn)一個(gè)理想中的目標(biāo)峰？ 那么如何建立良好的色譜分析方法了？ 方法建立一般包括以下步驟: 基線分離和合理的分離時(shí)間 樣品組成和分離目標(biāo)的評(píng)估; 樣品的預(yù)處理;色譜模式的選擇; 檢測(cè)器的選擇; 分離條件的選擇; 潛在問題的預(yù)估,識(shí)別和解決之道; 方法確證和系統(tǒng)適應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的確定。 這其中的一些步驟并不是必需的,或者它們不需要我們花太多的精力。“困難”的樣品和要求很高的分析程序可能會(huì)超出簡(jiǎn)單重復(fù)上面所羅列的步驟的范疇。也就是說(shuō),在方法建立過程中出現(xiàn)特殊問題的時(shí)候,需要有一個(gè)邏輯的對(duì)策,以色譜操作員之前的經(jīng)驗(yàn)和對(duì)文獻(xiàn)記錄的接觸或熟悉程度為基礎(chǔ)。 ▉ 樣品組成和分離目標(biāo)的評(píng)估 在方法建立之初,應(yīng)該對(duì)樣品的化學(xué)組成有一定的掌握。如果樣品中有酸性或者堿性的化合物,那就有必要在流動(dòng)相里加入緩沖液來(lái)控制流動(dòng)相的pH;樣品化合物的pKa值,如果知道的話,對(duì)方法建立都會(huì)非常有幫助,樣品的分子量也有可能影響起始實(shí)驗(yàn)分離條件的選擇,樣品中存在有對(duì)映異構(gòu)體的則需要針對(duì)它們的分離建立一個(gè)特殊的方法。 一個(gè)樣品的分離目標(biāo)可能不僅僅局限于足夠的分離度和最短的分離時(shí)間。對(duì)于最終方法的常規(guī)應(yīng)用取決于可用的設(shè)備,梯度洗脫可能無(wú)法實(shí)現(xiàn)(那就需要等度洗脫的方法)。痕量分析,也就是測(cè)定化合物中的雜質(zhì),可能對(duì)樣品配備和檢測(cè)器都有額外的要求。定量分析要求設(shè)定最低的精確度(比如主要成分在±(1%-2%)之間和痕量成分在±(10%-20%)之間),然而,通常來(lái)講樣品中只有一些成分需要被分離;例如,血中或尿液中的藥物或者水或土壤里樣品里的殺蟲劑。 ▉ 樣品的預(yù)處理 在樣品進(jìn)樣之前可能需要對(duì)樣品做一些處理以便能除去那些可能會(huì)損害柱子或者干擾目標(biāo)的化合物成分。樣品的預(yù)處理流程包括多個(gè)步驟,并且也包括使用各種各樣的分離基質(zhì)。因?yàn)檫@個(gè)原因這些步驟比后面的HPLC分離更加難以建立。當(dāng)相似的樣品和樣品基質(zhì)的預(yù)處理流程已經(jīng)存在(或者在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室建立或者在文獻(xiàn)里報(bào)道過),針對(duì)分析樣品來(lái)使用或者改編現(xiàn)有的預(yù)處理流程通常是比較好的方法,因?yàn)檫@樣就可以避免完全重新建立樣品預(yù)處理的程序了。 ▉ 色譜模式的選擇 反相色譜法是HPLC方法建立的一個(gè)默認(rèn)選擇。但是,取決于樣品本身,其他的色譜模式也許會(huì)更合適。通常要等到初始的使用反相色譜法(RPC)的實(shí)驗(yàn)無(wú)法成功的時(shí)候,使用其他色譜模式的需求才會(huì)變得更加明顯。同理,如果樣品中有異構(gòu)體化合物,而且難以被反相色譜分離,那么使用以無(wú)鍵合的硅膠填充的色譜柱的正相色譜法(NPC)可能會(huì)更加容易獲得成功。無(wú)鍵合硅膠的正相色譜法也是制備規(guī)模分離的首選。 ▉ 檢測(cè)器的選擇 當(dāng)樣品成分中有足夠的生色團(tuán),可調(diào)波長(zhǎng)的UV檢測(cè)器一般是首選。目標(biāo)樣品成分的分子結(jié)構(gòu)可能預(yù)示使用一種檢測(cè)器會(huì)比另外一種檢測(cè)器更加合適,假如樣品成分的結(jié)構(gòu)是未知的,并且可能不能被UV檢測(cè),那么我們?cè)诜治鲞@些樣品的時(shí)候就需要使用基于蒸發(fā)光散射或者(比較少見)折光指數(shù)的非特異性檢測(cè)器。質(zhì)譜檢測(cè)器(LC-MS)可用作UV檢測(cè)器的補(bǔ)充,因?yàn)樗亩喙δ苄砸虼丝梢杂糜谔幚砗芏囝愋偷臉悠泛头蛛x目標(biāo)。我們可以預(yù)見,將來(lái)LC-MS技術(shù)的使用可能會(huì)大幅上升,而質(zhì)譜檢測(cè)器可能有一天會(huì)成為大多數(shù)HPLC應(yīng)用首選的檢測(cè)器。 ▉ 分離條件的選擇 對(duì)于大多數(shù)樣品,我們可以根據(jù)三個(gè)連續(xù)的步驟以一個(gè)系統(tǒng)化、反復(fù)測(cè)試的方法來(lái)進(jìn)行(分離條件的選擇)： 1、改變流動(dòng)相的強(qiáng)度(%B)直到實(shí)現(xiàn)合適的保留范圍,比如,1≤K≤10； 2、應(yīng)對(duì)不同的分離條件進(jìn)行研究直到獲得可接受的選擇性(a值)和分離度為止。為了改善選擇性,首先需要改變的色譜條件應(yīng)為%B(例如±10%B)和溫度(例如30-50℃),如果一些峰仍然重疊或者分離不徹底,也可以改變其他條件來(lái)改善選擇性。 3、改變柱子的條件:柱子長(zhǎng)度、顆粒大小和(或)流動(dòng)相流速。改變柱子條件的確能夠稍微提高塔板數(shù)N和分離度,但代價(jià)通常是要忍受更長(zhǎng)的分離時(shí)間(實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間),當(dāng)優(yōu)化選擇性完成之后,樣品的分離度比必需的(R>>2)還要更好的話,那么通過把柱子長(zhǎng)度縮短和(或)者增加流動(dòng)相流速就讓實(shí)驗(yàn)時(shí)間大幅縮短�；谏厦婷枋�，在多數(shù)情況下,滿意的分離效果可以在一天或者兩天內(nèi)實(shí)現(xiàn)。 對(duì)于那些涉及大量樣品的分析方法,在保持足夠分離度的同時(shí)還要讓實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間盡可能地短,因此在實(shí)驗(yàn)的初期花更多的時(shí)間展開“篩選”實(shí)驗(yàn)是更有價(jià)值的。實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)使用不同的柱子、不同的B溶劑和不同的流動(dòng)相pH以及不同的溫度。在實(shí)驗(yàn)中使用梯度洗脫的方法有助于避免研究每個(gè)變量(例如柱溫、色譜柱的類型都屬于變量)時(shí)都需要分別優(yōu)化%B值的麻煩。 還有一個(gè)方法就是搜索文獻(xiàn)中對(duì)于同樣或者類似樣品的分離方法的記載。在此基礎(chǔ)上還需要不斷進(jìn)行反復(fù)試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化色譜條件直到獲得適合的分離效果。我們不推薦這個(gè)方法,因?yàn)槲墨I(xiàn)中的方法可能存在不足;這此不足可能會(huì)延誤我們之后為了獲得最終可靠的分離方法而作的嘗試。然而除了選擇分離條件之外,文獻(xiàn)記載的分離方法對(duì)于選擇檢測(cè)器和檢測(cè)條件,以及為一個(gè)特殊的分析物或樣品選擇樣品配備方法都很有用。 關(guān)注微信公眾號(hào)“質(zhì)譜學(xué)堂”， 即可領(lǐng)取 ”色譜系列叢書 ” 相關(guān)書籍，共12本。 |
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2樓2021-09-24 10:45:51
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