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臨床與分析

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專業(yè): 樣品前處理方法與技術

[交流] 液相學習|1|：液相（LC）方法開發(fā)的常規(guī)套路（上）已有1人參與

▉ 導讀

您有沒有遭遇過在儀器前折騰了半天，還有出現(xiàn)一個理想中的目標峰？

那么如何建立良好的色譜分析方法了？

方法建立一般包括以下步驟:

基線分離和合理的分離時間
樣品組成和分離目標的評估;
樣品的預處理;色譜模式的選擇;
檢測器的選擇;
分離條件的選擇;
潛在問題的預估,識別和解決之道;
方法確證和系統(tǒng)適應標準的確定。

這其中的一些步驟并不是必需的,或者它們不需要我們花太多的精力。“困難”的樣品和要求很高的分析程序可能會超出簡單重復上面所羅列的步驟的范疇。也就是說,在方法建立過程中出現(xiàn)特殊問題的時候,需要有一個邏輯的對策,以色譜操作員之前的經(jīng)驗和對文獻記錄的接觸或熟悉程度為基礎。

▉ 樣品組成和分離目標的評估

在方法建立之初,應該對樣品的化學組成有一定的掌握。如果樣品中有酸性或者堿性的化合物,那就有必要在流動相里加入緩沖液來控制流動相的pH;樣品化合物的pKa值,如果知道的話,對方法建立都會非常有幫助,樣品的分子量也有可能影響起始實驗分離條件的選擇,樣品中存在有對映異構體的則需要針對它們的分離建立一個特殊的方法。

一個樣品的分離目標可能不僅僅局限于足夠的分離度和最短的分離時間。對于最終方法的常規(guī)應用取決于可用的設備,梯度洗脫可能無法實現(xiàn)(那就需要等度洗脫的方法)。痕量分析,也就是測定化合物中的雜質,可能對樣品配備和檢測器都有額外的要求。定量分析要求設定最低的精確度(比如主要成分在±(1%-2%)之間和痕量成分在±(10%-20%)之間),然而,通常來講樣品中只有一些成分需要被分離;例如,血中或尿液中的藥物或者水或土壤里樣品里的殺蟲劑。

▉ 樣品的預處理

在樣品進樣之前可能需要對樣品做一些處理以便能除去那些可能會損害柱子或者干擾目標的化合物成分。樣品的預處理流程包括多個步驟,并且也包括使用各種各樣的分離基質。因為這個原因這些步驟比后面的HPLC分離更加難以建立。當相似的樣品和樣品基質的預處理流程已經(jīng)存在(或者在同一個實驗室建立或者在文獻里報道過),針對分析樣品來使用或者改編現(xiàn)有的預處理流程通常是比較好的方法,因為這樣就可以避免完全重新建立樣品預處理的程序了。

▉ 色譜模式的選擇

反相色譜法是HPLC方法建立的一個默認選擇。但是,取決于樣品本身,其他的色譜模式也許會更合適。通常要等到初始的使用反相色譜法(RPC)的實驗無法成功的時候,使用其他色譜模式的需求才會變得更加明顯。同理,如果樣品中有異構體化合物,而且難以被反相色譜分離,那么使用以無鍵合的硅膠填充的色譜柱的正相色譜法(NPC)可能會更加容易獲得成功。無鍵合硅膠的正相色譜法也是制備規(guī)模分離的首選。

▉ 檢測器的選擇

當樣品成分中有足夠的生色團,可調波長的UV檢測器一般是首選。目標樣品成分的分子結構可能預示使用一種檢測器會比另外一種檢測器更加合適,假如樣品成分的結構是未知的,并且可能不能被UV檢測,那么我們在分析這些樣品的時候就需要使用基于蒸發(fā)光散射或者(比較少見)折光指數(shù)的非特異性檢測器。質譜檢測器(LC-MS)可用作UV檢測器的補充,因為它的多功能性因此可以用于處理很多類型的樣品和分離目標。我們可以預見,將來LC-MS技術的使用可能會大幅上升,而質譜檢測器可能有一天會成為大多數(shù)HPLC應用首選的檢測器。

▉ 分離條件的選擇

對于大多數(shù)樣品,我們可以根據(jù)三個連續(xù)的步驟以一個系統(tǒng)化、反復測試的方法來進行(分離條件的選擇)：

1、改變流動相的強度(%B)直到實現(xiàn)合適的保留范圍,比如,1≤K≤10；

2、應對不同的分離條件進行研究直到獲得可接受的選擇性(a值)和分離度為止。為了改善選擇性,首先需要改變的色譜條件應為%B(例如±10%B)和溫度(例如30-50℃),如果一些峰仍然重疊或者分離不徹底,也可以改變其他條件來改善選擇性。

3、改變柱子的條件:柱子長度、顆粒大小和(或)流動相流速。改變柱子條件的確能夠稍微提高塔板數(shù)N和分離度,但代價通常是要忍受更長的分離時間(實驗操作時間),當優(yōu)化選擇性完成之后,樣品的分離度比必需的(R>>2)還要更好的話,那么通過把柱子長度縮短和(或)者增加流動相流速就讓實驗時間大幅縮短。基于上面描述，在多數(shù)情況下,滿意的分離效果可以在一天或者兩天內實現(xiàn)。

對于那些涉及大量樣品的分析方法,在保持足夠分離度的同時還要讓實驗操作時間盡可能地短,因此在實驗的初期花更多的時間展開“篩選”實驗是更有價值的。實驗中可能會使用不同的柱子、不同的B溶劑和不同的流動相pH以及不同的溫度。在實驗中使用梯度洗脫的方法有助于避免研究每個變量(例如柱溫、色譜柱的類型都屬于變量)時都需要分別優(yōu)化%B值的麻煩。

還有一個方法就是搜索文獻中對于同樣或者類似樣品的分離方法的記載。在此基礎上還需要不斷進行反復試驗來優(yōu)化色譜條件直到獲得適合的分離效果。我們不推薦這個方法,因為文獻中的方法可能存在不足;這此不足可能會延誤我們之后為了獲得最終可靠的分離方法而作的嘗試。然而除了選擇分離條件之外,文獻記載的分離方法對于選擇檢測器和檢測條件,以及為一個特殊的分析物或樣品選擇樣品配備方法都很有用。

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