最新91精品视频在线,日本激情中文字幕在线播放,成人精品一区二区久久久

版塊導航: 正在加載中...

客戶端APP下載

論文輔導

調(diào)劑小程序

登錄注冊

應《網(wǎng)絡安全法》要求，自2017年10月1日起，未進行實名認證將不得使用互聯(lián)網(wǎng)跟帖服務。為保障您的帳號能夠正常使用，請盡快對帳號進行手機號驗證，感謝您的理解與支持！

24小時熱門版塊排行榜

>論壇更新日志 (4136)
>考研 (639)
>導師招生 (515)
>文獻求助 (177)
>蟲友互識 (138)
>考博 (102)
>博后之家 (99)
>碩博家園 (85)
>休閑灌水 (66)
>基金申請 (60)
>論文投稿 (48)
>公派出國 (38)
>招聘信息布告欄 (35)
>找工作 (20)
>SciFinder/Reaxys (19)
>教師之家 (18)

返回列表

NanoFCMlxq

新蟲 (正式寫手)

應助: 0 (幼兒園)
金幣: 1017.6
帖子: 787
在線: 8.6小時
蟲號: 26342463

已領完

外泌體相關研究文獻分享,輕松讀完一篇文獻（四）: 領取紅包 (小木蟲手機app專屬紅包)

掃一掃，下載小木蟲客戶端

今天分享一篇發(fā)表在Molecular Therapy（2020年IF=8.986）上的文章，名為《A versatile platform for generating engineered extracellular vesicles with defined therapeutic properties》[1]（一個用于產(chǎn)生具有明確治療特性的工程細胞外囊泡的多功能平臺）。該文是美國Codiak BioSciences公司發(fā)表的研究成果。

細胞外囊泡(EVs)是一種重要的細胞間通訊系統(tǒng)，促進了細胞間大分子的轉(zhuǎn)移。將外源性分子結(jié)合到EV表面或包裹在其中是產(chǎn)生治療性EV的關鍵策略。本研究鑒定了兩種“支架”蛋白，PTGFRN和BASP1，它們被優(yōu)先選擇放到EV中，能夠高密度的表達而且可以廣泛裝載各種分子，包括細胞因子、抗體片段、RNA結(jié)合蛋白、疫苗抗原、Cas9和TNF超家族成員。分子以高密度加載到EVs中，當融合到全長或截斷形式的PTGFRN或BASP1時，顯示出強大的體外活性。此外，這些工程EVs在各種動物模型中都保留了藥效學活性。這個工程平臺提供了一種簡單的方法，用多樣化的大分子來功能化EVs，并代表了一種釋放EVs的治療潛力的重要進步。

研究過程及結(jié)果：

一、高密度EV支架蛋白的鑒定

我們認為，通過對高度純化的EVs進行詳細的表征，可確定能作為EVs裝載功能性分子的支架蛋白。為此，我們開發(fā)了一種從大量細胞培養(yǎng)上清中嚴格且可重復純化EVs的方法。從適應懸液的HEK293細胞中提取的細胞培養(yǎng)基通過連續(xù)的過濾和離心步驟處理，通過iodixanol梯度純化得到粗EV顆粒。我們將這個梯度分成四個組分（F1-F4），收集遷移到相鄰密度層之間的組分，并使用超微結(jié)構(gòu)和生化技術分析這些組分是否存在EVs。

負染透射電鏡(TEM)分析顯示，在較低密度組分中主要存在直徑為30- 200 nm的囊泡，而較高密度組分似乎主要包含蛋白質(zhì)，非囊泡物質(zhì)。冷凍透射電鏡(cryo-EM)對F1的分析顯示，負染透射電鏡有不明顯的無泡狀、網(wǎng)狀物質(zhì)的存在。密度梯度分離后進行2萬x g離心步驟去除這些主要由肌動蛋白和肌動蛋白結(jié)合蛋白組成的高階復合物。去除這些成分后，cryo-EM證實存在脂膜分隔的囊泡，無細胞碎片。

我們發(fā)現(xiàn)，外泌體的主要脂質(zhì)成分膽固醇主要存在于F1中，而大部分DNA和蛋白質(zhì)存在于高密度組分中。納米顆粒跟蹤分析(NTA)測定的F1、F3和F4的顆粒濃度相似，盡管TEM觀察到的囊泡比例存在顯著差異。蛋白酶K處理這些組分導致高密度組分NTA結(jié)果顯著變化，而F1的影響最小。這些數(shù)據(jù)表明，需要詳細的生化特性來區(qū)分EVs顆粒和非EVs顆粒，這些顆粒用不太嚴格的分離方法共同純化。

SDS-PAGE和免疫印跡分析顯示，經(jīng)常報道的EV標記CD9、CD63、CD81和SDCBP富集在低密度組分F1和F2中，這與TEM觀察到的囊泡含量一致。單顆粒流式細胞儀（NanoFCM）分析tetraspanin標記物表明F1中存在囊泡亞群，這與以前的報道一致。形成大的寡聚復合物的蛋白質(zhì)，如 LGALS3BP和染色質(zhì)相關的HMGB1和HIST3H3富集于F4中，而在低密度EVs富集組分中不存在。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白CANX僅在細胞裂解液(CL)中發(fā)現(xiàn)，這表明在超離前大部分EV污染標記物已被去除。

通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)發(fā)現(xiàn)，已知的EV蛋白如PDCD6IP、MFGE8和整合素b1和a4在F1中富集，而在較高密度的組分F3和F4中基本不存在。F4主要由分泌的細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白(LAMA5/B1/C1、NID1、TNC、AGRN和HSPG2)和組蛋白(HIST-2H2AB、3H2BB、1H3A和2H2AC)組成，EVs相關蛋白基本被除去。免疫球蛋白超家族(IgSF)-EWI和MARCKS蛋白家族的幾個成員在F1中高度富集，而在F3和F4中基本不存在，如

TGFRN, IGSF8, MARCKS, MARCKSL1和BASP1。這些蛋白被選擇作為EVs特異性支架候選者進行進一步評價。

結(jié)合電鏡和生化分析，這些數(shù)據(jù)表明F1高度富集囊泡表達典型EV標記物，并且沒有遷移到F2-F4的非囊泡物質(zhì)。后續(xù)所有實驗均使用F1 EVs進行。

二、工程蛋白EVs富集

我們使用flag標記的GFP作為替代載體分子，評估了這些蛋白引導融合蛋白進入EVs的相對能力。將LC-MS/MS鑒定的5種EV蛋白與常用的EV定位蛋白：CD9，CD63，CD81，一種棕櫚�；瘶擞汸alm，pD和LAMP2B進行比較。通過使用編碼GFP融合到每個支架上的質(zhì)粒進行抗生素篩選，建立了穩(wěn)定的懸浮適應的HEK293細胞系。除非另有說明，本報告中描述的所有工程EVs均來自穩(wěn)定選擇的細胞池。

GFP融合蛋白被包裝進EVs的效率是通過比較細胞內(nèi)和EVs中GFP水平來確定的。雖然通過流式檢測，大多數(shù)靶向構(gòu)建物的細胞GFP表達相似，但通過ELISA定量檢測，EVs相關的GFP表達有廣泛差異，其中MARCKSL1、BASP1、MARCKS和PTGFRN在EV中GFP表達水平最高。盡管非靶向細胞質(zhì)GFP (cGFP)在細胞中的表達量是其他結(jié)構(gòu)的10倍，但它僅在EV中表現(xiàn)出較弱的定位，這表明GFP在細胞中的豐富表達不足以被隨機包裝到EV中。

接下來，我們試圖確定過表達的支架蛋白是均勻分布在EVs中還是富集在亞群中。納米流式分析儀(NanoFCM)是一種專門用于分析小于可見光波長顆粒的流式分析儀，用于測定單個囊泡的GFP熒光。先前報道的表達GFP融合支架蛋白的細胞產(chǎn)生的EVs，GFP+囊泡從低(LAMP2B, pD, Palm: 10%-35%)到中等 (CD9, CD63, CD81: 50%-65%)，與MARKCSL1, BASP1, MARCKS和PTGFRN融合，產(chǎn)生明確的GFP+峰，95%的分析顆粒顯示可檢測到GFP熒光。結(jié)合ELISA檢測結(jié)果，數(shù)據(jù)表明，MARCKSL1、BASP1、MARCKS或PTGFRN過表達可得到F1中EVs中大量、均勻分布。

三、 EV支架候選PTGFRN的表征

PTGFRN和IGSF8屬于IgSF-EWI蛋白，一個I型跨膜糖蛋白家族，結(jié)構(gòu)上由IgV串聯(lián)結(jié)構(gòu)域和短的胞質(zhì)尾組成。盡管它們結(jié)構(gòu)相似，但胞內(nèi)IGSF8-GFP的表達在EVs中只出現(xiàn)少量的富集，而PTGFRN-GFP的表達則出現(xiàn)異常高的水平。

為了更好地理解定位EV的PTGFRN的特征，在預測的IgV域邊界產(chǎn)生了一系列PTGFRN-GFP截段。大部分截段顯示出與全長PTGFRN(FL)相似的細胞GFP表達水平；然而，截段D149-D537顯示EV定位明顯減少。使用針對胞內(nèi)GFP標簽的抗體對純化的EVs進行免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)意外的55kDa膜結(jié)合產(chǎn)物為PTGFRN的截斷形式。該產(chǎn)物也可以在FL支架中檢測到，盡管水平較低。PTGFRN-GFP融合蛋白在細胞裂解液中基本完整，表明蛋白水解發(fā)生在EV生物發(fā)生過程中或釋放后。因此，對這一蛋白水解事件進行表征并防止其發(fā)生可能有助于開發(fā)穩(wěn)定的、高密度的表面工程EVs。

我們猜測豐富的EV蛋白酶ADAM10可能是導致PTGFRN截斷的原因。瞬時轉(zhuǎn)染FL-GFP和d395 - GFP后，用ADAM10敲除細胞系用于生產(chǎn)EVs。從ADAM10 KO細胞純化的EVs中不包含在轉(zhuǎn)染D395-GFP的野生型(WT)產(chǎn)生細胞中發(fā)現(xiàn)的55-kDa產(chǎn)物，這表明PTGFRN的截斷形式易受位點特異性ADAM10裂解的影響。我們通過移除假定的切割位點，確定了一個PTGFRN截斷對ADAM10蛋白水解具有抗性，導致每個EV的GFP比任何其他測試的截段更多。FL和PTGFRN優(yōu)化后的Δ687截斷形式都被用于進一步評價目標蛋白支架。

四、BASP1

盡管缺乏明顯的序列同源性，但MARCKS、MARCKSL1和BASP1通過2位甘氨酸殘基的n -末端肉豆�；鸵粋€多堿效應域與細胞膜內(nèi)小葉相關聯(lián)。當MARCKS和MARCKSL1的c端截斷(只包含前30個氨基酸，去除多堿區(qū)域)降低了40%-80%的GFP結(jié)合。對BASP1進行類似的截斷(只包含前30個氨基酸，但包含多堿基區(qū)域)，通過ELISA得到了與全長支架相當?shù)乃健＿M一步定義所需的最小的序列用于EVs定位，我們做了一系列的增量BASP1截斷融合GFP和觀察大量加載全部結(jié)構(gòu)至少包含最初的8個殘基。這個最小肽序列只包含BASP1多基結(jié)構(gòu)域10個賴氨酸殘基中的3個。雖然EV定位需要一部分多基結(jié)構(gòu)域，但這是不夠的，因為豆粕�；稽c(G2A)的突變完全破壞了包含整個多基結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。這些數(shù)據(jù)表明，MARCKS家族蛋白需要脂質(zhì)修飾和一個多堿序列來高密度載入EVs，這兩者都可以被容納在一個8-氨基酸肽中。

五、 PTGFRN可以使EV表面顯示多種蛋白質(zhì)

通過將一系列結(jié)構(gòu)和生物多樣性的蛋白融合到PTGFRN表面暴露的N端來作為其表達支架的評估。為了比較工程EVs的特異蛋白活性，根據(jù)EV濃度和絕對融合蛋白濃度，給出體外最大有效/抑制濃度(EC50/IC50)數(shù)據(jù)。通過下調(diào)CD8+T細胞上的IL-7受體(IL-7R)來檢測，F(xiàn)L PTGFRN和截斷的D687支架在EVs表面有效地顯示了活性白細胞介素-7 (IL-7)，一種分泌的細胞因子。PTGFRN構(gòu)建物每顆粒的效力是IL-7融合pD (EV工程中常用的支架)的250倍(IC50= 2.79E+8 [FL]， 3.99 e +8 [D687] vs 7.10E+10 ([pD] p/mL)。當歸一化IL-7總量時，所有EVs結(jié)構(gòu)顯示出相似的ic50值。

TNFSF成員CD40配體(CD40L)是一種在活化的T細胞上瞬時表達的II型跨膜蛋白，它通過同型三聚體受體CD40來誘導信號傳導。我們將單鏈三聚體CD40L胞外結(jié)構(gòu)域(ECD) 與PTGFRN融合，用初級B細胞活性試驗測定其效能。這些EVs具有比從CD40L過表達細胞中分離出的EVs高至少50倍的效力，顯示了將治療分子附加到EVs特異性支架的重要性(EC50= 1.12E+9 [FL]， 1.89E+9 [D687] vs 6.09E+10 [CD40L] p/mL)。此外，CD40L-FL EVs比單獨使用重組CD40L ECD的效力強20倍，表明在生物膜中呈現(xiàn)這些分子可能會增強信號傳導(EC50= 1.02 [FL] vs 19.7 [Rec.] ng/mL)。相同方法用于評估另一個TNFSF成員，LIGHT，證明了PTGFRN作為展示TNFSF配體的EV支架的多功能性。

為了探索在EVs上顯示抗體片段等靶向配體的可行性，我們將靶向免疫細胞的單鏈抗原結(jié)合(scFab)和可變(scFv)片段分別添加到兩種PTGFRN支架上，包括小鼠145-2C11抗cd3 ε抗體。抗cd3抗體是一種有效的免疫抑制劑和耐受性誘導劑，用于通過CD3ε結(jié)合減輕器官移植排斥反應的癥狀。與可溶性抗cd3抗體相比，EVs與FL和Δ687 PTGFRN融合后修飾的抗CD3 scFab同樣下調(diào)了原代小鼠CD4+ T細胞上T細胞受體(TCR)的表達。通過PTGFRN融合在EVs表面顯示scFv、scFab或單域VHH形式，進一步證明了該體系的多功能性。

IL-12是由抗原呈遞細胞(APCs)自然產(chǎn)生的，作為一種穩(wěn)定相關的異二聚體，并通過刺激腫瘤微環(huán)境(TME)中的免疫細胞分泌干擾素γ (IFNg)來提供抗腫瘤免疫。我們構(gòu)建了一個將PTGFRN融合到由p35和p40的亞基由一個柔性的連接器連接組成的單鏈版本的人IL-12。與FL或D687 PTGFRN融合的結(jié)果與IFN在外周血單個核細胞有相似效能(PBMCs;EC50= 4.23E+8 [FL] vs 6.70E+8 [Δ687] p/mL)。當歸一化到IL-12濃度時，IL-12-FL EVs和重組IL-12表現(xiàn)出相似的效價(EC50= 0.277 [FL] vs 0.269[Rec.] ng/mL)，比D687-IL-12強6倍(EC50= 1.77 ng/mL)。雖然我們觀察到供體與供體之間的顯著差異，但在每個供體內(nèi)部，治療組之間的相對EC50值保持一致。這些IL-12構(gòu)建物的小鼠模型也被建立，在100和200 ng劑量的重組小鼠IL-12或EV當量IL-12劑量下，在同基因B16F10黑色素瘤模型中評估了抗腫瘤活性。與重組IL-12相比，瘤內(nèi)給予小鼠IL-12- FL EVs改善了腫瘤生長抑制和生存。

結(jié)果就展示這么多，有興趣的話可以自己找這篇文獻具體看，或者私聊我要文獻資料，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻：

[1]Dooley, K; McConnell, RE; Xu, K; et al.A versatile platform for generating engineered extracellular vesicles with defined therapeutic properties.[J].Mol Ther.2021,29(5):1729-1743

發(fā)自小木蟲Android客戶端

回復此樓

» 猜你喜歡

290求調(diào)劑已經(jīng)有6人回復
工科278分求調(diào)劑已經(jīng)有5人回復
考研一志愿長安大學材料與化工309分請求調(diào)劑已經(jīng)有9人回復
304求調(diào)劑（085602一志愿985）已經(jīng)有9人回復
0856材料與化工309分求調(diào)劑已經(jīng)有5人回復
282分材料專業(yè)求調(diào)劑院校已經(jīng)有24人回復
材料工程085601調(diào)劑求老師收留已經(jīng)有11人回復
化工學碩306求調(diào)劑已經(jīng)有7人回復
308求調(diào)劑已經(jīng)有10人回復
314求調(diào)劑已經(jīng)有4人回復

» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)

» 搶金幣啦！回帖就可以得到:

查看全部散金貼

1樓 2021-05-11 15:42:50

已閱回復此樓關注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

簡單回復

tzynew2樓

2021-05-11 15:43 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

Will_Wu3樓

2021-05-11 15:43 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

秋土豆香4樓

2021-05-11 15:49 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

學員09BSPV5樓

2021-05-11 15:50 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

6683771636樓

2021-05-11 15:51 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲IOS客戶端

BiotageAB7樓

2021-05-11 15:52 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

babyzyy8樓

2021-05-11 15:53 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲IOS客戶端

huxi_89樓

2021-05-11 15:53 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

48422307310樓

2021-05-11 15:58 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲IOS客戶端

longwave11樓

2021-05-11 15:59 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

82581629612樓

2021-05-11 16:03 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲IOS客戶端

立林25836913樓

2021-05-11 16:06 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲IOS客戶端

56618038914樓

2021-05-11 16:09 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲IOS客戶端

79875209115樓

2021-05-11 16:14 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲IOS客戶端

哈哈迪達啦16樓

2021-05-11 16:26 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

gao1992070717樓

2021-05-11 16:35 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

fgmsyutong18樓

2021-05-11 16:37 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

云在青天19樓

2021-05-11 17:01 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

yi心靈感應20樓

2021-05-11 17:01 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

Towerq21樓

2021-05-11 17:36 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲IOS客戶端

相關版塊跳轉(zhuǎn) 我要訂閱樓主 NanoFCMlxq 的主題更新

返回列表

普通表情龍兔虎貓高級回復 (可上傳附件)

最具人氣熱帖推薦 [查看全部]		作者	回/看	最后發(fā)表

[考研] 考研一志愿長安大學材料與化工309分請求調(diào)劑 +7	dtdxzxx 2026-03-06	9/450	2026-03-12 11:34 by 2020015
[基金申請] NSFC申報書里申請人簡歷中代表性論著還需要在申報書最后的附件里面再上傳一遍嗎 20+4	NSFC2026我來了 2026-03-10	10/500	2026-03-12 10:04 by 北京萊茵潤色
[考研] 271求調(diào)劑 +7	生如夏花… 2026-03-11	7/350	2026-03-12 09:32 by allen-yin
[考研] 一志愿北京化工大學材料與化工296分求調(diào)劑 +15	稻妻小編 2026-03-09	17/850	2026-03-11 22:45 by 2020015
[考研] 308求調(diào)劑 +4	是Lupa啊 2026-03-11	4/200	2026-03-11 20:01 by 清風月
[考研] 311求調(diào)劑 +6	zchqwer 2026-03-10	6/300	2026-03-11 15:54 by 30660438
[考研] 求調(diào)劑 +4	鶴遨予卿 2026-03-09	4/200	2026-03-11 10:47 by @颯颯颯颯
[考研] 材料調(diào)劑，307分 +12	張泳銘1 2026-03-09	13/650	2026-03-11 08:42 by 學員8dgXkO
[考研] 308求調(diào)劑 +4	是Lupa啊 2026-03-08	7/350	2026-03-10 18:25 by 清風月
[考研] 求調(diào)劑材料專碩293 +6	段_(:з」∠)_ 2026-03-10	6/300	2026-03-10 18:22 by ms629
[考研] 材料工程專碩調(diào)劑自薦信，初試323 +6	李白26 2026-03-07	6/300	2026-03-10 16:16 by 無際的草原
[考研] 材料專碩調(diào)劑 +7	慕辰123 2026-03-05	10/500	2026-03-10 14:22 by peike
[考研] 一志愿：武漢理工，材料工程，英二數(shù)二總分314 +3	2202020125 2026-03-10	4/200	2026-03-10 13:54 by xiongyaxuan
[考研] 復試調(diào)劑 +6	呼呼？~+123456 2026-03-08	8/400	2026-03-10 11:36 by 呼呼？~+123456
[考研] 320求調(diào)劑 +4	魏zy 2026-03-08	4/200	2026-03-09 16:14 by ruiyingmiao
[考研] 290 材料與化工求調(diào)劑 +7	Nebulala 2026-03-08	7/350	2026-03-09 05:21 by houyaoxu
[考博] 26年博士申請 +4	科研狗111 2026-03-07	4/200	2026-03-08 21:56 by 0611517sll
[考研] 288求調(diào)劑085600材料與化工 +13	Daunrin 2026-03-07	15/750	2026-03-08 19:10 by 加號+
[考研] 081700學碩一志愿北京化工大學數(shù)二英一過六級有競賽求調(diào)劑 +5	galaxary 2026-03-07	7/350	2026-03-08 04:37 by wang_dand
[考研] 一志愿211 085600 280數(shù)二英二求調(diào)劑 +3	月山斜 2026-03-06	3/150	2026-03-07 18:56 by houyaoxu

亭亭五月天在线观看,亭亭五月天在线观看,国产最新av一区二区,国产 高清 中文字幕,99re热久久亚洲综合精品成人,熟妇 一区二区三区,一级做a爰片性色毛片武则天,美女的骚穴视频播放,国产美女午夜免费视频

24小時熱門版塊排行榜

NanoFCMlxq

» 猜你喜歡

» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)

» 搶金幣啦！回帖就可以得到: 查看全部散金貼

亭亭五月天在线观看,亭亭五月天在线观看,国产最新av一区二区,国产高清中文字幕,99re热久久亚洲综合精品成人,熟妇一区二区三区,一级做a爰片性色毛片武则天,美女的骚穴视频播放,国产美女午夜免费视频

» 搶金幣啦！回帖就可以得到:

查看全部散金貼