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外泌體相關(guān)研究文獻(xiàn)分享,輕松讀完一篇文獻(xiàn)（四）: 領(lǐng)取紅包 (小木蟲手機(jī)app專屬紅包)

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今天分享一篇發(fā)表在Molecular Therapy（2020年IF=8.986）上的文章，名為《A versatile platform for generating engineered extracellular vesicles with defined therapeutic properties》[1]（一個用于產(chǎn)生具有明確治療特性的工程細(xì)胞外囊泡的多功能平臺）。該文是美國Codiak BioSciences公司發(fā)表的研究成果。

細(xì)胞外囊泡(EVs)是一種重要的細(xì)胞間通訊系統(tǒng)，促進(jìn)了細(xì)胞間大分子的轉(zhuǎn)移。將外源性分子結(jié)合到EV表面或包裹在其中是產(chǎn)生治療性EV的關(guān)鍵策略。本研究鑒定了兩種“支架”蛋白，PTGFRN和BASP1，它們被優(yōu)先選擇放到EV中，能夠高密度的表達(dá)而且可以廣泛裝載各種分子，包括細(xì)胞因子、抗體片段、RNA結(jié)合蛋白、疫苗抗原、Cas9和TNF超家族成員。分子以高密度加載到EVs中，當(dāng)融合到全長或截?cái)嘈问降腜TGFRN或BASP1時，顯示出強(qiáng)大的體外活性。此外，這些工程EVs在各種動物模型中都保留了藥效學(xué)活性。這個工程平臺提供了一種簡單的方法，用多樣化的大分子來功能化EVs，并代表了一種釋放EVs的治療潛力的重要進(jìn)步。

研究過程及結(jié)果：

一、高密度EV支架蛋白的鑒定

我們認(rèn)為，通過對高度純化的EVs進(jìn)行詳細(xì)的表征，可確定能作為EVs裝載功能性分子的支架蛋白。為此，我們開發(fā)了一種從大量細(xì)胞培養(yǎng)上清中嚴(yán)格且可重復(fù)純化EVs的方法。從適應(yīng)懸液的HEK293細(xì)胞中提取的細(xì)胞培養(yǎng)基通過連續(xù)的過濾和離心步驟處理，通過iodixanol梯度純化得到粗EV顆粒。我們將這個梯度分成四個組分（F1-F4），收集遷移到相鄰密度層之間的組分，并使用超微結(jié)構(gòu)和生化技術(shù)分析這些組分是否存在EVs。

負(fù)染透射電鏡(TEM)分析顯示，在較低密度組分中主要存在直徑為30- 200 nm的囊泡，而較高密度組分似乎主要包含蛋白質(zhì)，非囊泡物質(zhì)。冷凍透射電鏡(cryo-EM)對F1的分析顯示，負(fù)染透射電鏡有不明顯的無泡狀、網(wǎng)狀物質(zhì)的存在。密度梯度分離后進(jìn)行2萬x g離心步驟去除這些主要由肌動蛋白和肌動蛋白結(jié)合蛋白組成的高階復(fù)合物。去除這些成分后，cryo-EM證實(shí)存在脂膜分隔的囊泡，無細(xì)胞碎片。

我們發(fā)現(xiàn)，外泌體的主要脂質(zhì)成分膽固醇主要存在于F1中，而大部分DNA和蛋白質(zhì)存在于高密度組分中。納米顆粒跟蹤分析(NTA)測定的F1、F3和F4的顆粒濃度相似，盡管TEM觀察到的囊泡比例存在顯著差異。蛋白酶K處理這些組分導(dǎo)致高密度組分NTA結(jié)果顯著變化，而F1的影響最小。這些數(shù)據(jù)表明，需要詳細(xì)的生化特性來區(qū)分EVs顆粒和非EVs顆粒，這些顆粒用不太嚴(yán)格的分離方法共同純化。

SDS-PAGE和免疫印跡分析顯示，經(jīng)常報(bào)道的EV標(biāo)記CD9、CD63、CD81和SDCBP富集在低密度組分F1和F2中，這與TEM觀察到的囊泡含量一致。單顆粒流式細(xì)胞儀（NanoFCM）分析tetraspanin標(biāo)記物表明F1中存在囊泡亞群，這與以前的報(bào)道一致。形成大的寡聚復(fù)合物的蛋白質(zhì)，如 LGALS3BP和染色質(zhì)相關(guān)的HMGB1和HIST3H3富集于F4中，而在低密度EVs富集組分中不存在。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白CANX僅在細(xì)胞裂解液(CL)中發(fā)現(xiàn)，這表明在超離前大部分EV污染標(biāo)記物已被去除。

通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)發(fā)現(xiàn)，已知的EV蛋白如PDCD6IP、MFGE8和整合素b1和a4在F1中富集，而在較高密度的組分F3和F4中基本不存在。F4主要由分泌的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白(LAMA5/B1/C1、NID1、TNC、AGRN和HSPG2)和組蛋白(HIST-2H2AB、3H2BB、1H3A和2H2AC)組成，EVs相關(guān)蛋白基本被除去。免疫球蛋白超家族(IgSF)-EWI和MARCKS蛋白家族的幾個成員在F1中高度富集，而在F3和F4中基本不存在，如

TGFRN, IGSF8, MARCKS, MARCKSL1和BASP1。這些蛋白被選擇作為EVs特異性支架候選者進(jìn)行進(jìn)一步評價。

結(jié)合電鏡和生化分析，這些數(shù)據(jù)表明F1高度富集囊泡表達(dá)典型EV標(biāo)記物，并且沒有遷移到F2-F4的非囊泡物質(zhì)。后續(xù)所有實(shí)驗(yàn)均使用F1 EVs進(jìn)行。

二、工程蛋白EVs富集

我們使用flag標(biāo)記的GFP作為替代載體分子，評估了這些蛋白引導(dǎo)融合蛋白進(jìn)入EVs的相對能力。將LC-MS/MS鑒定的5種EV蛋白與常用的EV定位蛋白：CD9，CD63，CD81，一種棕櫚�；瘶�(biāo)記Palm，pD和LAMP2B進(jìn)行比較。通過使用編碼GFP融合到每個支架上的質(zhì)粒進(jìn)行抗生素篩選，建立了穩(wěn)定的懸浮適應(yīng)的HEK293細(xì)胞系。除非另有說明，本報(bào)告中描述的所有工程EVs均來自穩(wěn)定選擇的細(xì)胞池。

GFP融合蛋白被包裝進(jìn)EVs的效率是通過比較細(xì)胞內(nèi)和EVs中GFP水平來確定的。雖然通過流式檢測，大多數(shù)靶向構(gòu)建物的細(xì)胞GFP表達(dá)相似，但通過ELISA定量檢測，EVs相關(guān)的GFP表達(dá)有廣泛差異，其中MARCKSL1、BASP1、MARCKS和PTGFRN在EV中GFP表達(dá)水平最高。盡管非靶向細(xì)胞質(zhì)GFP (cGFP)在細(xì)胞中的表達(dá)量是其他結(jié)構(gòu)的10倍，但它僅在EV中表現(xiàn)出較弱的定位，這表明GFP在細(xì)胞中的豐富表達(dá)不足以被隨機(jī)包裝到EV中。

接下來，我們試圖確定過表達(dá)的支架蛋白是均勻分布在EVs中還是富集在亞群中。納米流式分析儀(NanoFCM)是一種專門用于分析小于可見光波長顆粒的流式分析儀，用于測定單個囊泡的GFP熒光。先前報(bào)道的表達(dá)GFP融合支架蛋白的細(xì)胞產(chǎn)生的EVs，GFP+囊泡從低(LAMP2B, pD, Palm: 10%-35%)到中等 (CD9, CD63, CD81: 50%-65%)，與MARKCSL1, BASP1, MARCKS和PTGFRN融合，產(chǎn)生明確的GFP+峰，95%的分析顆粒顯示可檢測到GFP熒光。結(jié)合ELISA檢測結(jié)果，數(shù)據(jù)表明，MARCKSL1、BASP1、MARCKS或PTGFRN過表達(dá)可得到F1中EVs中大量、均勻分布。

三、 EV支架候選PTGFRN的表征

PTGFRN和IGSF8屬于IgSF-EWI蛋白，一個I型跨膜糖蛋白家族，結(jié)構(gòu)上由IgV串聯(lián)結(jié)構(gòu)域和短的胞質(zhì)尾組成。盡管它們結(jié)構(gòu)相似，但胞內(nèi)IGSF8-GFP的表達(dá)在EVs中只出現(xiàn)少量的富集，而PTGFRN-GFP的表達(dá)則出現(xiàn)異常高的水平。

為了更好地理解定位EV的PTGFRN的特征，在預(yù)測的IgV域邊界產(chǎn)生了一系列PTGFRN-GFP截段。大部分截段顯示出與全長PTGFRN(FL)相似的細(xì)胞GFP表達(dá)水平；然而，截段D149-D537顯示EV定位明顯減少。使用針對胞內(nèi)GFP標(biāo)簽的抗體對純化的EVs進(jìn)行免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)意外的55kDa膜結(jié)合產(chǎn)物為PTGFRN的截?cái)嘈问健Ｔ摦a(chǎn)物也可以在FL支架中檢測到，盡管水平較低。PTGFRN-GFP融合蛋白在細(xì)胞裂解液中基本完整，表明蛋白水解發(fā)生在EV生物發(fā)生過程中或釋放后。因此，對這一蛋白水解事件進(jìn)行表征并防止其發(fā)生可能有助于開發(fā)穩(wěn)定的、高密度的表面工程EVs。

我們猜測豐富的EV蛋白酶ADAM10可能是導(dǎo)致PTGFRN截?cái)嗟脑�。瞬時轉(zhuǎn)染FL-GFP和d395 - GFP后，用ADAM10敲除細(xì)胞系用于生產(chǎn)EVs。從ADAM10 KO細(xì)胞純化的EVs中不包含在轉(zhuǎn)染D395-GFP的野生型(WT)產(chǎn)生細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的55-kDa產(chǎn)物，這表明PTGFRN的截?cái)嘈问揭资芪稽c(diǎn)特異性ADAM10裂解的影響。我們通過移除假定的切割位點(diǎn)，確定了一個PTGFRN截?cái)鄬DAM10蛋白水解具有抗性，導(dǎo)致每個EV的GFP比任何其他測試的截段更多。FL和PTGFRN優(yōu)化后的Δ687截?cái)嘈问蕉急挥糜谶M(jìn)一步評價目標(biāo)蛋白支架。

四、BASP1

盡管缺乏明顯的序列同源性，但MARCKS、MARCKSL1和BASP1通過2位甘氨酸殘基的n -末端肉豆�；鸵粋€多堿效應(yīng)域與細(xì)胞膜內(nèi)小葉相關(guān)聯(lián)。當(dāng)MARCKS和MARCKSL1的c端截?cái)?只包含前30個氨基酸，去除多堿區(qū)域)降低了40%-80%的GFP結(jié)合。對BASP1進(jìn)行類似的截?cái)?只包含前30個氨基酸，但包含多堿基區(qū)域)，通過ELISA得到了與全長支架相當(dāng)?shù)乃�。進(jìn)一步定義所需的最小的序列用于EVs定位，我們做了一系列的增量BASP1截?cái)嗳诤螱FP和觀察大量加載全部結(jié)構(gòu)至少包含最初的8個殘基。這個最小肽序列只包含BASP1多基結(jié)構(gòu)域10個賴氨酸殘基中的3個。雖然EV定位需要一部分多基結(jié)構(gòu)域，但這是不夠的，因?yàn)槎蛊甚；稽c(diǎn)(G2A)的突變完全破壞了包含整個多基結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。這些數(shù)據(jù)表明，MARCKS家族蛋白需要脂質(zhì)修飾和一個多堿序列來高密度載入EVs，這兩者都可以被容納在一個8-氨基酸肽中。

五、 PTGFRN可以使EV表面顯示多種蛋白質(zhì)

通過將一系列結(jié)構(gòu)和生物多樣性的蛋白融合到PTGFRN表面暴露的N端來作為其表達(dá)支架的評估。為了比較工程EVs的特異蛋白活性，根據(jù)EV濃度和絕對融合蛋白濃度，給出體外最大有效/抑制濃度(EC50/IC50)數(shù)據(jù)。通過下調(diào)CD8+T細(xì)胞上的IL-7受體(IL-7R)來檢測，F(xiàn)L PTGFRN和截?cái)嗟腄687支架在EVs表面有效地顯示了活性白細(xì)胞介素-7 (IL-7)，一種分泌的細(xì)胞因子。PTGFRN構(gòu)建物每顆粒的效力是IL-7融合pD (EV工程中常用的支架)的250倍(IC50= 2.79E+8 [FL]， 3.99 e +8 [D687] vs 7.10E+10 ([pD] p/mL)。當(dāng)歸一化IL-7總量時，所有EVs結(jié)構(gòu)顯示出相似的ic50值。

TNFSF成員CD40配體(CD40L)是一種在活化的T細(xì)胞上瞬時表達(dá)的II型跨膜蛋白，它通過同型三聚體受體CD40來誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)。我們將單鏈三聚體CD40L胞外結(jié)構(gòu)域(ECD) 與PTGFRN融合，用初級B細(xì)胞活性試驗(yàn)測定其效能。這些EVs具有比從CD40L過表達(dá)細(xì)胞中分離出的EVs高至少50倍的效力，顯示了將治療分子附加到EVs特異性支架的重要性(EC50= 1.12E+9 [FL]， 1.89E+9 [D687] vs 6.09E+10 [CD40L] p/mL)。此外，CD40L-FL EVs比單獨(dú)使用重組CD40L ECD的效力強(qiáng)20倍，表明在生物膜中呈現(xiàn)這些分子可能會增強(qiáng)信號傳導(dǎo)(EC50= 1.02 [FL] vs 19.7 [Rec.] ng/mL)。相同方法用于評估另一個TNFSF成員，LIGHT，證明了PTGFRN作為展示TNFSF配體的EV支架的多功能性。

為了探索在EVs上顯示抗體片段等靶向配體的可行性，我們將靶向免疫細(xì)胞的單鏈抗原結(jié)合(scFab)和可變(scFv)片段分別添加到兩種PTGFRN支架上，包括小鼠145-2C11抗cd3 ε抗體。抗cd3抗體是一種有效的免疫抑制劑和耐受性誘導(dǎo)劑，用于通過CD3ε結(jié)合減輕器官移植排斥反應(yīng)的癥狀。與可溶性抗cd3抗體相比，EVs與FL和Δ687 PTGFRN融合后修飾的抗CD3 scFab同樣下調(diào)了原代小鼠CD4+ T細(xì)胞上T細(xì)胞受體(TCR)的表達(dá)。通過PTGFRN融合在EVs表面顯示scFv、scFab或單域VHH形式，進(jìn)一步證明了該體系的多功能性。

IL-12是由抗原呈遞細(xì)胞(APCs)自然產(chǎn)生的，作為一種穩(wěn)定相關(guān)的異二聚體，并通過刺激腫瘤微環(huán)境(TME)中的免疫細(xì)胞分泌干擾素γ (IFNg)來提供抗腫瘤免疫。我們構(gòu)建了一個將PTGFRN融合到由p35和p40的亞基由一個柔性的連接器連接組成的單鏈版本的人IL-12。與FL或D687 PTGFRN融合的結(jié)果與IFN在外周血單個核細(xì)胞有相似效能(PBMCs;EC50= 4.23E+8 [FL] vs 6.70E+8 [Δ687] p/mL)。當(dāng)歸一化到IL-12濃度時，IL-12-FL EVs和重組IL-12表現(xiàn)出相似的效價(EC50= 0.277 [FL] vs 0.269[Rec.] ng/mL)，比D687-IL-12強(qiáng)6倍(EC50= 1.77 ng/mL)。雖然我們觀察到供體與供體之間的顯著差異，但在每個供體內(nèi)部，治療組之間的相對EC50值保持一致。這些IL-12構(gòu)建物的小鼠模型也被建立，在100和200 ng劑量的重組小鼠IL-12或EV當(dāng)量IL-12劑量下，在同基因B16F10黑色素瘤模型中評估了抗腫瘤活性。與重組IL-12相比，瘤內(nèi)給予小鼠IL-12- FL EVs改善了腫瘤生長抑制和生存。

結(jié)果就展示這么多，有興趣的話可以自己找這篇文獻(xiàn)具體看，或者私聊我要文獻(xiàn)資料，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻(xiàn)：

[1]Dooley, K; McConnell, RE; Xu, K; et al.A versatile platform for generating engineered extracellular vesicles with defined therapeutic properties.[J].Mol Ther.2021,29(5):1729-1743

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