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茯苓鴨新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
α-葡萄糖苷酶抑制活性實(shí)驗(yàn) 已有1人參與
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一、目前在體系優(yōu)化，遇到的問(wèn)題是：未出現(xiàn)平臺(tái)期，每次實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)有一定差距，曲線趨勢(shì)不統(tǒng)一，無(wú)法確定最適酶濃度和底物蔗糖濃度，希望有前輩能提些建議。 二、實(shí)驗(yàn)用的方法是： ①0.1M的PBS 70ul和20ul酶混合預(yù)熱10min,（空白組為不加酶，其他條件皆一致） ②加入20ul蔗糖反應(yīng)30min， ③加入100ul的0.2M的碳酸鈉終止，（以上反應(yīng)在1.5ml的離心管內(nèi)完成，與在酶標(biāo)板內(nèi)反應(yīng)所得數(shù)據(jù)對(duì)比而言，前者反應(yīng)更充分） ④取50ul反應(yīng)液，往其中加入150ul葡萄糖工作液，再反應(yīng)15min后酶標(biāo)儀測(cè)OD。 三、但在體系優(yōu)化這個(gè)環(huán)節(jié)就出現(xiàn)了問(wèn)題，我參考文獻(xiàn)，選取1.0U/ml的酶，加入不同濃度蔗糖（10、20、40、60、80、100、120、140、160mmol/l）但沒(méi)有平臺(tái)期，蔗糖60與80這邊較平，但160的OD又很高。之后又重復(fù)了好幾次，但是曲線規(guī)律不統(tǒng)一，仍然無(wú)法確定最適蔗糖濃度，但文獻(xiàn)里又做出來(lái)了，不清楚我到底漏了什么細(xì)節(jié)，希望做過(guò)類似實(shí)驗(yàn)的前輩能指導(dǎo)一下。（ps先前我增加過(guò)終止液的濃度后，發(fā)現(xiàn)有平臺(tái)期，但是測(cè)出來(lái)的數(shù)據(jù)太小了，意義不大。) @lifeliuyan 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
茯苓鴨: 金幣+5 2021-02-19 21:47:41
茯苓鴨: 金幣+5 2021-02-19 21:47:41
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1. 葡萄糖氧化酶法是基于生物催化的方法來(lái)測(cè)定葡萄糖的含量，受pH的影響，所以試劑盒的說(shuō)明書(shū)里是建議受測(cè)樣品體積：GOD試液=1：10。在測(cè)定抑制劑效力的反應(yīng)時(shí)間到了之后加入碳酸鈉會(huì)使pH值升高，但你在使用GOD試液的時(shí)候卻是受測(cè)樣品體積：GOD試液=1：3，GOD試液自帶的緩沖系統(tǒng)不足以抵消樣品所帶緩沖液的沖擊，使GOD的顯色反應(yīng)不能在最適pH進(jìn)行，建議參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 2.我用過(guò)GOD法，是反應(yīng)時(shí)間到了之后沸水浴滅活，受測(cè)樣品體積：GOD試液=1：10。我也試過(guò)加碳酸鈉來(lái)制止反應(yīng)，但最終選擇了沸水浴。 3.GOD法是有線性范圍的，葡萄糖的含量超過(guò)一定范圍后線性變差，在葡萄糖含量倍增時(shí)，增加的讀數(shù)值小于1倍，并且在葡萄糖含量繼續(xù)倍增后讀數(shù)的增幅繼續(xù)減小。即，假設(shè)葡萄糖含量為0、1、2、4、8、16，讀數(shù)可能為0、1、2、4、7、10，含量為8時(shí)已超出該方法的線性范圍。線性范圍受顯色溫度和時(shí)間影響，要自己摸索，并注意所得結(jié)果能夠重現(xiàn)。 4.你的步驟描述不全面，抑制劑在哪一步加？你以蔗糖作為α-葡萄糖苷酶的底物？要描述全面才行。 |
6樓2021-01-27 16:58:00
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