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小小書蟲飛新蟲 (小有名氣)
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[交流]
等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理及應(yīng)用
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摘要 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增的一類新型核酸擴(kuò)增技術(shù)�；谠摷夹g(shù)建立的方法操作簡便，且具有較高的靈敏度與特異性，在臨床與科研等方面展現(xiàn)了較好的應(yīng)用前景。本文就環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、交叉引物擴(kuò)增、鏈替代擴(kuò)增、依賴核酸序列的等溫?cái)U(kuò)增和滾環(huán)擴(kuò)增等技術(shù)的原理、特點(diǎn)及應(yīng)用進(jìn)行了綜述。 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（isothermal amplification technology，ITA）是近年來發(fā)展起來的基于恒溫?cái)U(kuò)增的新型核酸擴(kuò)增技術(shù),主要包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、交叉引物擴(kuò)增（crossing priming amplification，CPA）、鏈替代擴(kuò)增（strand displacement amplification，SDA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA)、依賴核酸序列的擴(kuò)增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA)和依賴解旋酶的擴(kuò)增（helicase-dependent amplification，HDA)。盡管各種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)均采用恒溫?cái)U(kuò)增，但引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增原理差異較大，本文就其原理、特點(diǎn)及應(yīng)用進(jìn)行綜述。 一、LAMP 1．原理： 2000年，日本學(xué)者Notomi等報(bào)道了LAMP技術(shù)。LAMP在60~65 ℃條件下進(jìn)行，需要4條引物和具有鏈置換功能的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶（DNA polymerase of Bacillus stearothermophilus，BstDNA聚合酶）。外引物與PCR引物類似，而內(nèi)引物則含有兩段序列。過程如下：（1）內(nèi)引物結(jié)合目的基因，在BstDNA聚合酶的作用下延伸為雙鏈。外引物與雙鏈DNA的5′端結(jié)合，在一端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。另一端經(jīng)過同樣過程，形成兩端為環(huán)的啞鈴狀結(jié)構(gòu)。（2）啞鈴狀結(jié)構(gòu)的單鏈DNA具有模板與引物的雙重功能，在Bst聚合酶的催化下即能延伸。（3）內(nèi)引物也能與環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合，在酶的作用下進(jìn)行延伸。 2．特點(diǎn)： LAMP的優(yōu)點(diǎn)為特異性和靈敏度高；擴(kuò)增產(chǎn)物可通過電泳、電化學(xué)傳感器、橫向流動(dòng)試紙條等方法判定結(jié)果[10]。局限性在于引物設(shè)計(jì)繁瑣，易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，可通過標(biāo)準(zhǔn)化引物和調(diào)整緩沖液濃度克服此缺點(diǎn)。 3．應(yīng)用： LAMP可用于病原體檢測(cè)，Lin等利用LAMP技術(shù)檢測(cè)呼吸道樣本中的耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌，該方法檢測(cè)16s RNA基因檢測(cè)限為104 CFU/ml（CFU為菌落形成單位），mecA基因檢測(cè)限為105 CFU/ml；Ulep等開發(fā)了一個(gè)基于液滴LAMP的檢測(cè)平臺(tái)，定量檢測(cè)5%稀釋血液樣本中的O157：H7型大腸桿菌，其檢測(cè)限為10 CFU/μl。改良LAMP用于檢測(cè)肺孢子蟲，與其他常見肺部感染無交叉反應(yīng)，且比常規(guī)PCR靈敏度高1 000倍。此外，LAMP還可用于人乳頭瘤病毒檢測(cè)、食品中腸炎沙門菌檢測(cè)[等。 LAMP還可用于癌癥中突變基因的檢測(cè)，Itonaga等[17]利用肽核酸-鎖核酸（peptide nucleic acid-locked nucleic acid，PNA-LNA）介導(dǎo)的LAMP檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞系中的基因突變，可在突變野生比為0.1%的情況下檢測(cè)突變基因。Raack等利用肽核酸介導(dǎo)的LAMP分析法，檢測(cè)經(jīng)細(xì)胞裂解液處理的口腔拭子樣本中的基因突變，并顯示出比Sanger測(cè)序更好的靈敏度。 二、CPA 1．原理： CPA在63 ℃左右進(jìn)行，依賴Bst DNA聚合酶、甜菜堿和交叉引物。根據(jù)交叉引物數(shù)量的不同，可分為雙交叉引物擴(kuò)增和單交叉引物擴(kuò)增。 雙交叉引物擴(kuò)增使用兩條交叉引物和兩條剝離引物。兩條交叉引物分別與模板鏈互補(bǔ)結(jié)合后延伸，隨后剝離引物在Bst DNA聚合酶的作用下將新合成的單鏈剝離，最后兩條交叉引物在Bst DNA聚合酶的作用下以新生單鏈為模板合成大量目的片段。 單交叉引物擴(kuò)增使用一條交叉引物、兩條剝離引物和兩條普通引物。首先交叉引物與模板鏈結(jié)合并延伸為雙鏈，而剝離引物在Bst DNA聚合酶的作用下將新鏈與模板分離；隨后普通引物以新鏈為模板，合成兩條不同長度的單鏈DNA；最后以這兩條單鏈為模板，以交叉引物與普通引物為引物對(duì)，形成擴(kuò)增循環(huán)。 2．特點(diǎn)： CPA最顯著的優(yōu)點(diǎn)是有極高的靈敏度和特異性[19]。缺點(diǎn)在于引物復(fù)雜、假陽性率高。 3．應(yīng)用： 由于靈敏度高，CPA主要用于微量病原體核酸的檢測(cè)：Qiao等采用CPA和免疫印跡法檢測(cè)葡萄球菌的凝固酶基因，檢出限為3 627 fg（1 fg=10-15g）；Meng等采用CPA檢測(cè)嗜水氣單胞菌，檢出限約為5×103 CFU/g。反轉(zhuǎn)錄交叉引物擴(kuò)增結(jié)合核酸檢測(cè)試紙條還可用于豬流行性腹瀉病毒的檢測(cè)[21]。 三、SDA 1．原理： SDA的反應(yīng)溫度約為37 ℃，反應(yīng)需要限制性核酸內(nèi)切酶、鏈置換DNA聚合酶和兩對(duì)引物，且其中一對(duì)引物（P1和P2）含有內(nèi)切酶識(shí)別序列。反應(yīng)開始時(shí)P1和P2與模板鏈互補(bǔ)結(jié)合，在聚合酶的催化下延伸為雙鏈，隨后內(nèi)切酶識(shí)別雙鏈兩端的酶切位點(diǎn)，切割形成黏性末端。第二對(duì)引物結(jié)合模板鏈末端，在聚合酶的作用下合成新鏈同時(shí)置換出一條單鏈。 2．特點(diǎn)： SDA反應(yīng)時(shí)間短（約15~20 min），與橫向流動(dòng)試紙條、熒光免疫技術(shù)等結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)即時(shí)檢測(cè)。但需昂貴的酶類和非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸、不能完成長片段的擴(kuò)增，且產(chǎn)物兩端還殘留核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列。 3．應(yīng)用： SDA可用于蛋白質(zhì)的檢測(cè),Zhang等使用熒光SDA方法擴(kuò)增生物素和鏈霉親和素結(jié)合后形成的特異性序列，進(jìn)行信號(hào)放大，從而實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素的檢測(cè)，該方法檢測(cè)限為92 pmol/L。SDA結(jié)合熒光或橫向流動(dòng)試紙條可用于快速檢測(cè)病原菌，Toley等[24]利用SDA技術(shù)開發(fā)了金黃色葡萄球菌的檢測(cè)試紙條，檢測(cè)限低至每5拷貝/μl；Du等基于SDA開發(fā)了檢測(cè)尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的傳感平臺(tái)，檢測(cè)限為1×10-4 U/ml（U為酶的活性單位）。 四、RPA 1．原理： RPA的反應(yīng)溫度為37~42 ℃，反應(yīng)體系包括1對(duì)引物和3種關(guān)鍵酶：能與寡核苷酸引物結(jié)合的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（single strand DNA-binding protein，SSB）和鏈置換DNA聚合酶。反應(yīng)開始時(shí)引物與重組酶結(jié)合形成引物重組酶復(fù)合物，并與模板鏈上相應(yīng)位點(diǎn)互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致雙鏈DNA構(gòu)象發(fā)生改變，并在具有鏈置換特性的DNA聚合酶的催化下延伸形成完整雙鏈。反應(yīng)時(shí)單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合游離單鏈，保持其穩(wěn)定性。 2．特點(diǎn)： RPA有很高的特異性和擴(kuò)增效率，凍干試劑也可用；但擴(kuò)增體系存在大量酶類,去除蛋白后才能電泳或后續(xù)試驗(yàn)。 3．應(yīng)用： RPA可用于病原體的檢測(cè)和突變基因的檢測(cè)，Kersting等建立了肺炎球菌和嗜肺軍團(tuán)菌的雙重RPA，用于非典型肺炎的快速診斷，25 min即可完成檢測(cè)，靈敏度可達(dá)0.2 CFU/μl；RPA與橫向流動(dòng)試紙條結(jié)合，用于檢測(cè)環(huán)境中的弓形蟲。Martorell等利用RPA對(duì)癌細(xì)胞磷酯酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy Kinase，PIK3CA）基因的野生型及其突變型進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行快速雜交測(cè)定和比色測(cè)定，可在95%的野生型DNA的背景下識(shí)別特定突變。 五、NASBA 1．原理： NASBA技術(shù)是檢測(cè)RNA的等溫?cái)U(kuò)增方法，通常在42 ℃左右進(jìn)行[28]，需要AMV（avian myeloblastosis virus）逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H、T7 RNA聚合酶和一對(duì)引物來完成。其正向引物包含T7啟動(dòng)子互補(bǔ)序列。反應(yīng)過程中正向引物與RNA鏈結(jié)合，由AMV酶催化形成DNA-RNA雙鏈；RNA酶H消化雜交雙鏈中的RNA,保留DNA單鏈；在反向引物與AMV酶的作用下形成含有T7啟動(dòng)子序列的DNA雙鏈；在T7 RNA聚合酶的作用下完成轉(zhuǎn)錄過程，產(chǎn)生大量目的RNA。 2．特點(diǎn)： NASBA的優(yōu)點(diǎn)在于產(chǎn)物是單鏈RNA，不易造成遺留污染；由于轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生大量RNA，具有更高的靈敏度；將反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)一步完成，適用于RNA樣品的分析，缺點(diǎn)是需用RNA酶抑制劑防止RNA降解。 3．應(yīng)用： NASBA可用于病原體（尤其是RNA病毒）檢測(cè)�；诎滩《綬NA的NASBA的數(shù)字化芯片可用于量化人血漿樣本中的病毒載量，可檢測(cè)低至10拷貝/μl。Clancy等[30]用熒光標(biāo)記的探針實(shí)時(shí)檢測(cè)流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌三重非競(jìng)爭NASBA的擴(kuò)增產(chǎn)物，用于診斷細(xì)菌性腦膜炎，該方法特異性為100%，3種細(xì)菌的檢出限分別為55.36、0.99和57.24個(gè)細(xì)胞當(dāng)量。實(shí)時(shí)定量的NASBA還可用擴(kuò)增滅活卵囊中的MIC1 mRNA，檢測(cè)并區(qū)分人畜共患的小隱孢子蟲和人隱孢子蟲。 六、RCA 1．原理： RCA借鑒了自然界中環(huán)狀DNA復(fù)制方式。所需酶為phi29DNA聚合酶，在37 ℃左右進(jìn)行。普通RCA的過程為：引物與環(huán)狀DNA模板結(jié)合后延伸，生成含有大量目的基因的DNA單鏈。 在此基礎(chǔ)上還發(fā)展出了多種改進(jìn)技術(shù)，如多位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增的多引物RCA[6]、使用兩條引物提高擴(kuò)增效率的指數(shù)RCA。 2．特點(diǎn)： RCA的優(yōu)點(diǎn)有：擴(kuò)增效率高；種類多，應(yīng)用廣；產(chǎn)物為單鏈DNA，能與探針直接結(jié)合實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大[33]。局限性在于所需模板為環(huán)狀DNA。 3．應(yīng)用： RCA及其改進(jìn)技術(shù)有著廣泛的應(yīng)用。RCA產(chǎn)物經(jīng)納米材料信號(hào)放大，結(jié)合生物傳感器，用于檢測(cè)雙酚A含量，檢測(cè)限為5.4×10-17 mol/L；切口增強(qiáng)RCA結(jié)合生物傳感器和熒光，用于檢測(cè)miRNA（microRNA），檢出限為10 pmol/L；超支化RCA結(jié)合分子信標(biāo)與熒光，可以定量檢測(cè)低至1×10-18 mol/L的miRNA-21；Ciftci等設(shè)計(jì)了一種基于RCA的檢測(cè)方法，結(jié)合鏈霉親和素-生物素系統(tǒng),在電極網(wǎng)上通過葡萄糖氧化酶催化產(chǎn)生H2O2，將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電流信號(hào)，檢測(cè)埃博拉病毒RNA，檢出限為10 pmol/L。 七、HDA 1．原理： HDA模擬體內(nèi)DNA半保留復(fù)制過程，該反應(yīng)在37 ℃左右進(jìn)行，依賴于解旋酶、SSB、DNA聚合酶以及一對(duì)引物。過程為：DNA雙鏈在解旋酶的作用下解開，SSB與單鏈DNA結(jié)合保持其穩(wěn)定；同時(shí)引物與單鏈結(jié)合，在聚合酶的催化下形成雙鏈；新合成的DNA雙鏈作為模板進(jìn)入新一輪擴(kuò)增。 2．特點(diǎn)： HDA的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)迅速，靈敏度高；全程恒溫[38]；可直接用于熱處理裂解后的鼻咽拭子等樣本。缺點(diǎn)是受解旋速度限制，只能擴(kuò)增短片段；易產(chǎn)生引物二聚體，脫靶雜交體和非規(guī)范的褶皺等。 3．應(yīng)用： HDA可用于病原體的檢測(cè)：Barreda-García等[40]利用不對(duì)稱HDA，磁性包裹擴(kuò)增的單鏈DNA，結(jié)合電化學(xué)系統(tǒng)，能量化低至15個(gè)拷貝的結(jié)核分枝桿菌基因組DNA；固相HDA結(jié)合電化學(xué)傳感器可用于沙門菌的檢測(cè)，檢出限為10個(gè)拷貝。HDA擴(kuò)增反芻動(dòng)物相關(guān)的擬桿菌16S rRNA，結(jié)合橫向試紙條可用于檢測(cè)反芻動(dòng)物糞便污染源。 HDA還可用于miRNA的定量檢測(cè)：靶miRNA與線性DNA 3′末端特異性雜交形成DNA-miRNA異源雙鏈體，保護(hù)探針免受核酸外切酶的消化，隨后可以通過HDA技術(shù)擴(kuò)增剩余的探針，在30 min內(nèi)產(chǎn)生超高熒光信號(hào)，檢測(cè)限為12.8 fmol/L。 八、ERA 1、原理 酶促重組等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（ERA）是蘇州先達(dá)基因的具有全球自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一種恒溫的核酸快速擴(kuò)增技術(shù)，主要依賴能結(jié)合單鏈寡核苷酸引物的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶。在溫度為37℃~42℃的環(huán)境下，該重組酶可與引物DNA緊密結(jié)合，形成酶和引物的聚合體，當(dāng)引物在模板DNA上搜索到與之完全匹配的互補(bǔ)序列時(shí)， 在單鏈DNA結(jié)合蛋白的幫助下，打開模板 DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補(bǔ)鏈，擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)級(jí)增長。 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理及應(yīng)用 ERA技術(shù)原理 2．特點(diǎn)： 原理與RPA基本相似，可配套熒光檢測(cè)與試紙條檢測(cè) （1）簡單：操作簡便，非專業(yè)人員亦可完成樣本檢測(cè)； （2）快速：20分鐘內(nèi)完成檢測(cè)； （3）準(zhǔn)確：靈敏度可達(dá)到10拷貝以下； （4）便捷：37℃-42℃恒溫反應(yīng)，儀器便于攜帶，無需精密設(shè)備 （5）靈敏度、特異性高 3、應(yīng)用 1、研究診斷領(lǐng)域：針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染，提供一種快速、簡單、靈敏的檢測(cè)方法，只需要20分鐘便能得出結(jié)果 2、公共衛(wèi)生領(lǐng)域：針對(duì)危害公眾健康的呼吸道傳染性病原，腸道致病病原及生殖系統(tǒng)病原進(jìn)行快速檢測(cè) 3、食品安全領(lǐng)域：針對(duì)致病微生物、動(dòng)物源性成分和轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè) 4、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域：針對(duì)水產(chǎn)、畜牧養(yǎng)殖和寵物中各類病原，進(jìn)行早期快速檢測(cè)和診斷 九、總結(jié)與展望 與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在原理、特點(diǎn)、臨床應(yīng)用有所不同，見 表1。除此之外，各種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)之間也有很大差異，見表2。 由于快速靈敏、簡單便攜，ITA在分子診斷，尤其是床旁檢測(cè)及實(shí)地篩查方面有非常好的應(yīng)用前景，便攜化、精準(zhǔn)化、自動(dòng)化方法正在研究中。ITA結(jié)合分子信標(biāo)（熒光標(biāo)記的寡核苷酸鏈），可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，且具有高靈敏度和特異性；結(jié)合微流體芯片技術(shù)，將反應(yīng)過程轉(zhuǎn)載到由液相小室組成的芯片結(jié)構(gòu)上，再由熒光、電化學(xué)和質(zhì)譜等手段，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的快速、準(zhǔn)確和高通量分析；結(jié)合電化學(xué)傳感器或生物傳感器,可通過智能手機(jī)等實(shí)現(xiàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)顯示和在線存儲(chǔ)。 |
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