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等溫擴增技術(shù)的原理及應用
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摘要 等溫擴增技術(shù)是在恒溫條件下進行擴增的一類新型核酸擴增技術(shù)。基于該技術(shù)建立的方法操作簡便，且具有較高的靈敏度與特異性，在臨床與科研等方面展現(xiàn)了較好的應用前景。本文就環(huán)介導等溫擴增、交叉引物擴增、鏈替代擴增、依賴核酸序列的等溫擴增和滾環(huán)擴增等技術(shù)的原理、特點及應用進行了綜述。 等溫擴增技術(shù)（isothermal amplification technology，ITA）是近年來發(fā)展起來的基于恒溫擴增的新型核酸擴增技術(shù),主要包括環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、交叉引物擴增（crossing priming amplification，CPA）、鏈替代擴增（strand displacement amplification，SDA)、重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA)、依賴核酸序列的擴增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、滾環(huán)擴增（rolling circle amplification，RCA)和依賴解旋酶的擴增（helicase-dependent amplification，HDA)。盡管各種等溫擴增技術(shù)均采用恒溫擴增，但引物設(shè)計與擴增原理差異較大，本文就其原理、特點及應用進行綜述。 一、LAMP 1．原理： 2000年，日本學者Notomi等報道了LAMP技術(shù)。LAMP在60~65 ℃條件下進行，需要4條引物和具有鏈置換功能的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶（DNA polymerase of Bacillus stearothermophilus，BstDNA聚合酶）。外引物與PCR引物類似，而內(nèi)引物則含有兩段序列。過程如下：（1）內(nèi)引物結(jié)合目的基因，在BstDNA聚合酶的作用下延伸為雙鏈。外引物與雙鏈DNA的5′端結(jié)合，在一端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。另一端經(jīng)過同樣過程，形成兩端為環(huán)的啞鈴狀結(jié)構(gòu)。（2）啞鈴狀結(jié)構(gòu)的單鏈DNA具有模板與引物的雙重功能，在Bst聚合酶的催化下即能延伸。（3）內(nèi)引物也能與環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合，在酶的作用下進行延伸。 2．特點： LAMP的優(yōu)點為特異性和靈敏度高；擴增產(chǎn)物可通過電泳、電化學傳感器、橫向流動試紙條等方法判定結(jié)果[10]。局限性在于引物設(shè)計繁瑣，易出現(xiàn)非特異性擴增，可通過標準化引物和調(diào)整緩沖液濃度克服此缺點。 3．應用： LAMP可用于病原體檢測，Lin等利用LAMP技術(shù)檢測呼吸道樣本中的耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌，該方法檢測16s RNA基因檢測限為104 CFU/ml（CFU為菌落形成單位），mecA基因檢測限為105 CFU/ml；Ulep等開發(fā)了一個基于液滴LAMP的檢測平臺，定量檢測5%稀釋血液樣本中的O157：H7型大腸桿菌，其檢測限為10 CFU/μl。改良LAMP用于檢測肺孢子蟲，與其他常見肺部感染無交叉反應，且比常規(guī)PCR靈敏度高1 000倍。此外，LAMP還可用于人乳頭瘤病毒檢測、食品中腸炎沙門菌檢測[等。 LAMP還可用于癌癥中突變基因的檢測，Itonaga等[17]利用肽核酸-鎖核酸（peptide nucleic acid-locked nucleic acid，PNA-LNA）介導的LAMP檢測胰腺癌細胞系中的基因突變，可在突變野生比為0.1%的情況下檢測突變基因。Raack等利用肽核酸介導的LAMP分析法，檢測經(jīng)細胞裂解液處理的口腔拭子樣本中的基因突變，并顯示出比Sanger測序更好的靈敏度。 二、CPA 1．原理： CPA在63 ℃左右進行，依賴Bst DNA聚合酶、甜菜堿和交叉引物。根據(jù)交叉引物數(shù)量的不同，可分為雙交叉引物擴增和單交叉引物擴增。 雙交叉引物擴增使用兩條交叉引物和兩條剝離引物。兩條交叉引物分別與模板鏈互補結(jié)合后延伸，隨后剝離引物在Bst DNA聚合酶的作用下將新合成的單鏈剝離，最后兩條交叉引物在Bst DNA聚合酶的作用下以新生單鏈為模板合成大量目的片段。 單交叉引物擴增使用一條交叉引物、兩條剝離引物和兩條普通引物。首先交叉引物與模板鏈結(jié)合并延伸為雙鏈，而剝離引物在Bst DNA聚合酶的作用下將新鏈與模板分離；隨后普通引物以新鏈為模板，合成兩條不同長度的單鏈DNA；最后以這兩條單鏈為模板，以交叉引物與普通引物為引物對，形成擴增循環(huán)。 2．特點： CPA最顯著的優(yōu)點是有極高的靈敏度和特異性[19]。缺點在于引物復雜、假陽性率高。 3．應用： 由于靈敏度高，CPA主要用于微量病原體核酸的檢測：Qiao等采用CPA和免疫印跡法檢測葡萄球菌的凝固酶基因，檢出限為3 627 fg（1 fg=10-15g）；Meng等采用CPA檢測嗜水氣單胞菌，檢出限約為5×103 CFU/g。反轉(zhuǎn)錄交叉引物擴增結(jié)合核酸檢測試紙條還可用于豬流行性腹瀉病毒的檢測[21]。 三、SDA 1．原理： SDA的反應溫度約為37 ℃，反應需要限制性核酸內(nèi)切酶、鏈置換DNA聚合酶和兩對引物，且其中一對引物（P1和P2）含有內(nèi)切酶識別序列。反應開始時P1和P2與模板鏈互補結(jié)合，在聚合酶的催化下延伸為雙鏈，隨后內(nèi)切酶識別雙鏈兩端的酶切位點，切割形成黏性末端。第二對引物結(jié)合模板鏈末端，在聚合酶的作用下合成新鏈同時置換出一條單鏈。 2．特點： SDA反應時間短（約15~20 min），與橫向流動試紙條、熒光免疫技術(shù)等結(jié)合，可實現(xiàn)即時檢測。但需昂貴的酶類和非標準核苷酸、不能完成長片段的擴增，且產(chǎn)物兩端還殘留核酸內(nèi)切酶的識別序列。 3．應用： SDA可用于蛋白質(zhì)的檢測,Zhang等使用熒光SDA方法擴增生物素和鏈霉親和素結(jié)合后形成的特異性序列，進行信號放大，從而實現(xiàn)鏈霉親和素的檢測，該方法檢測限為92 pmol/L。SDA結(jié)合熒光或橫向流動試紙條可用于快速檢測病原菌，Toley等[24]利用SDA技術(shù)開發(fā)了金黃色葡萄球菌的檢測試紙條，檢測限低至每5拷貝/μl；Du等基于SDA開發(fā)了檢測尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的傳感平臺，檢測限為1×10-4 U/ml（U為酶的活性單位）。 四、RPA 1．原理： RPA的反應溫度為37~42 ℃，反應體系包括1對引物和3種關(guān)鍵酶：能與寡核苷酸引物結(jié)合的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（single strand DNA-binding protein，SSB）和鏈置換DNA聚合酶。反應開始時引物與重組酶結(jié)合形成引物重組酶復合物，并與模板鏈上相應位點互補結(jié)合，導致雙鏈DNA構(gòu)象發(fā)生改變，并在具有鏈置換特性的DNA聚合酶的催化下延伸形成完整雙鏈。反應時單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合游離單鏈，保持其穩(wěn)定性。 2．特點： RPA有很高的特異性和擴增效率，凍干試劑也可用；但擴增體系存在大量酶類,去除蛋白后才能電泳或后續(xù)試驗。 3．應用： RPA可用于病原體的檢測和突變基因的檢測，Kersting等建立了肺炎球菌和嗜肺軍團菌的雙重RPA，用于非典型肺炎的快速診斷，25 min即可完成檢測，靈敏度可達0.2 CFU/μl；RPA與橫向流動試紙條結(jié)合，用于檢測環(huán)境中的弓形蟲。Martorell等利用RPA對癌細胞磷酯酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy Kinase，PIK3CA）基因的野生型及其突變型進行檢測，并對擴增產(chǎn)物進行快速雜交測定和比色測定，可在95%的野生型DNA的背景下識別特定突變。 五、NASBA 1．原理： NASBA技術(shù)是檢測RNA的等溫擴增方法，通常在42 ℃左右進行[28]，需要AMV（avian myeloblastosis virus）逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H、T7 RNA聚合酶和一對引物來完成。其正向引物包含T7啟動子互補序列。反應過程中正向引物與RNA鏈結(jié)合，由AMV酶催化形成DNA-RNA雙鏈；RNA酶H消化雜交雙鏈中的RNA,保留DNA單鏈；在反向引物與AMV酶的作用下形成含有T7啟動子序列的DNA雙鏈；在T7 RNA聚合酶的作用下完成轉(zhuǎn)錄過程，產(chǎn)生大量目的RNA。 2．特點： NASBA的優(yōu)點在于產(chǎn)物是單鏈RNA，不易造成遺留污染；由于轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生大量RNA，具有更高的靈敏度；將反轉(zhuǎn)錄和擴增反應一步完成，適用于RNA樣品的分析，缺點是需用RNA酶抑制劑防止RNA降解。 3．應用： NASBA可用于病原體（尤其是RNA病毒）檢測�；诎滩《綬NA的NASBA的數(shù)字化芯片可用于量化人血漿樣本中的病毒載量，可檢測低至10拷貝/μl。Clancy等[30]用熒光標記的探針實時檢測流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌三重非競爭NASBA的擴增產(chǎn)物，用于診斷細菌性腦膜炎，該方法特異性為100%，3種細菌的檢出限分別為55.36、0.99和57.24個細胞當量。實時定量的NASBA還可用擴增滅活卵囊中的MIC1 mRNA，檢測并區(qū)分人畜共患的小隱孢子蟲和人隱孢子蟲。 六、RCA 1．原理： RCA借鑒了自然界中環(huán)狀DNA復制方式。所需酶為phi29DNA聚合酶，在37 ℃左右進行。普通RCA的過程為：引物與環(huán)狀DNA模板結(jié)合后延伸，生成含有大量目的基因的DNA單鏈。 在此基礎(chǔ)上還發(fā)展出了多種改進技術(shù)，如多位點同時進行擴增的多引物RCA[6]、使用兩條引物提高擴增效率的指數(shù)RCA。 2．特點： RCA的優(yōu)點有：擴增效率高；種類多，應用廣；產(chǎn)物為單鏈DNA，能與探針直接結(jié)合實現(xiàn)信號放大[33]。局限性在于所需模板為環(huán)狀DNA。 3．應用： RCA及其改進技術(shù)有著廣泛的應用。RCA產(chǎn)物經(jīng)納米材料信號放大，結(jié)合生物傳感器，用于檢測雙酚A含量，檢測限為5.4×10-17 mol/L；切口增強RCA結(jié)合生物傳感器和熒光，用于檢測miRNA（microRNA），檢出限為10 pmol/L；超支化RCA結(jié)合分子信標與熒光，可以定量檢測低至1×10-18 mol/L的miRNA-21；Ciftci等設(shè)計了一種基于RCA的檢測方法，結(jié)合鏈霉親和素-生物素系統(tǒng),在電極網(wǎng)上通過葡萄糖氧化酶催化產(chǎn)生H2O2，將化學信號轉(zhuǎn)化為電流信號，檢測埃博拉病毒RNA，檢出限為10 pmol/L。 七、HDA 1．原理： HDA模擬體內(nèi)DNA半保留復制過程，該反應在37 ℃左右進行，依賴于解旋酶、SSB、DNA聚合酶以及一對引物。過程為：DNA雙鏈在解旋酶的作用下解開，SSB與單鏈DNA結(jié)合保持其穩(wěn)定；同時引物與單鏈結(jié)合，在聚合酶的催化下形成雙鏈；新合成的DNA雙鏈作為模板進入新一輪擴增。 2．特點： HDA的優(yōu)點是反應迅速，靈敏度高；全程恒溫[38]；可直接用于熱處理裂解后的鼻咽拭子等樣本。缺點是受解旋速度限制，只能擴增短片段；易產(chǎn)生引物二聚體，脫靶雜交體和非規(guī)范的褶皺等。 3．應用： HDA可用于病原體的檢測：Barreda-García等[40]利用不對稱HDA，磁性包裹擴增的單鏈DNA，結(jié)合電化學系統(tǒng)，能量化低至15個拷貝的結(jié)核分枝桿菌基因組DNA；固相HDA結(jié)合電化學傳感器可用于沙門菌的檢測，檢出限為10個拷貝。HDA擴增反芻動物相關(guān)的擬桿菌16S rRNA，結(jié)合橫向試紙條可用于檢測反芻動物糞便污染源。 HDA還可用于miRNA的定量檢測：靶miRNA與線性DNA 3′末端特異性雜交形成DNA-miRNA異源雙鏈體，保護探針免受核酸外切酶的消化，隨后可以通過HDA技術(shù)擴增剩余的探針，在30 min內(nèi)產(chǎn)生超高熒光信號，檢測限為12.8 fmol/L。 八、ERA 1、原理 酶促重組等溫擴增技術(shù)（ERA）是蘇州先達基因的具有全球自主知識產(chǎn)權(quán)的一種恒溫的核酸快速擴增技術(shù)，主要依賴能結(jié)合單鏈寡核苷酸引物的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶。在溫度為37℃~42℃的環(huán)境下，該重組酶可與引物DNA緊密結(jié)合，形成酶和引物的聚合體，當引物在模板DNA上搜索到與之完全匹配的互補序列時， 在單鏈DNA結(jié)合蛋白的幫助下，打開模板 DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補鏈，擴增產(chǎn)物以指數(shù)級增長。 等溫擴增技術(shù)的原理及應用 ERA技術(shù)原理 2．特點： 原理與RPA基本相似，可配套熒光檢測與試紙條檢測 （1）簡單：操作簡便，非專業(yè)人員亦可完成樣本檢測； （2）快速：20分鐘內(nèi)完成檢測； （3）準確：靈敏度可達到10拷貝以下； （4）便捷：37℃-42℃恒溫反應，儀器便于攜帶，無需精密設(shè)備 （5）靈敏度、特異性高 3、應用 1、研究診斷領(lǐng)域：針對細胞培養(yǎng)中的支原體污染，提供一種快速、簡單、靈敏的檢測方法，只需要20分鐘便能得出結(jié)果 2、公共衛(wèi)生領(lǐng)域：針對危害公眾健康的呼吸道傳染性病原，腸道致病病原及生殖系統(tǒng)病原進行快速檢測 3、食品安全領(lǐng)域：針對致病微生物、動物源性成分和轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品進行快速現(xiàn)場檢測 4、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域：針對水產(chǎn)、畜牧養(yǎng)殖和寵物中各類病原，進行早期快速檢測和診斷 九、總結(jié)與展望 與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，等溫擴增技術(shù)在原理、特點、臨床應用有所不同，見 表1。除此之外，各種等溫擴增技術(shù)之間也有很大差異，見表2。 由于快速靈敏、簡單便攜，ITA在分子診斷，尤其是床旁檢測及實地篩查方面有非常好的應用前景，便攜化、精準化、自動化方法正在研究中。ITA結(jié)合分子信標（熒光標記的寡核苷酸鏈），可實現(xiàn)實時熒光定量檢測，且具有高靈敏度和特異性；結(jié)合微流體芯片技術(shù)，將反應過程轉(zhuǎn)載到由液相小室組成的芯片結(jié)構(gòu)上，再由熒光、電化學和質(zhì)譜等手段，實現(xiàn)對樣品的快速、準確和高通量分析；結(jié)合電化學傳感器或生物傳感器,可通過智能手機等實現(xiàn)檢測數(shù)據(jù)的實時顯示和在線存儲。 |
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