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一粒米飯的飯新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
Cas12a-crRNA復(fù)合體切割熒光報(bào)告分子，最后熒光強(qiáng)度很不穩(wěn)定，求助��！ 已有1人參與
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Cas12a-crRNA復(fù)合體切割熒光報(bào)告分子，最后體系中的熒光強(qiáng)度也太不穩(wěn)定了，求助是哪里出了問(wèn)題？ 具體過(guò)程就是先核算恒溫?cái)U(kuò)增，然后cas12a-crRNA復(fù)合體識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物并切割熒光報(bào)告分子。 操作在冰上進(jìn)行，已經(jīng)盡量控制每管的擴(kuò)增時(shí)間和切割時(shí)間相同了。而且我是把其他試劑先混合后再分裝與靶標(biāo)核酸孵育反應(yīng)的。 最后用qPCR儀測(cè)熒光，每次差距都特別大。我做了好多次，取其中最接近的三次結(jié)果做了誤差棒，如圖，還是很差。求助這是怎么回事兒��？ 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
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一粒米飯的飯
新蟲(chóng) (小有名氣)
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對(duì)的，就是恒溫?cái)U(kuò)增那一步有差別的。因?yàn)槲以谧鲮`敏度分析，就想看看最低檢測(cè)限是多少，但是就結(jié)果很不穩(wěn)定。那我再重復(fù)一下高濃度試試看，是我這個(gè)體系結(jié)果不穩(wěn)定還是因?yàn)榘袠?biāo)濃度低導(dǎo)致信號(hào)不穩(wěn)定。感謝您回復(fù)��！ 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
5樓2020-10-13 14:17:14
junjieshao
禁蟲(chóng) (小有名氣)
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2樓2020-10-13 05:00:06
pennchem
專(zhuān)家顧問(wèn) (正式寫(xiě)手)
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3樓2020-10-13 09:01:05
一粒米飯的飯
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不好意思，我也不知道怎么回事總發(fā)不了圖片  ，但是熒光強(qiáng)度確實(shí)像您講的那樣，不高，高濃度的是500左右，低一點(diǎn)的是200左右。那我再?lài)L試增加擴(kuò)增時(shí)間看看能不能增加一點(diǎn)產(chǎn)物量。或許您了解qPCR儀么，我現(xiàn)在有點(diǎn)懷疑是不是我不應(yīng)該用qPCR儀來(lái)檢測(cè)這個(gè)體系的熒光呀？發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
4樓2020-10-13 14:13:50
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