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TEV酶切mbp標簽蛋白，切不開
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如題，蛋白變性復性以后依然切不開 @gyesang 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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1 首先確認一下TEV的酶切位點有沒有突變或其它問題 2 確認一下是真的復性成功了還是只是形成了可溶性聚集體或其它非正確構象的狀態(tài)？有測活性嗎？有活性的話，有跑HPLC看一下是否是一個均一峰嗎？ 3 確認一下酶切溶液是否合適 4 以上都沒問題的話，可能是你的蛋白折疊后影響了酶切序列的暴露，由于存在空間位阻，TEV不能識別�？梢圆椴檫@個蛋白的結構有沒有人解出來，有的話可以看看N端的空間結構。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2020-08-20 14:35:18
3樓2020-08-21 13:30:38
zsygxh
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商業(yè)化的酶，按說明書的條件切的，默認酶切體系沒問題，沒切出來，那么大概率是你的蛋白的問題了。TEV識別的位點是ENLYFQG，切在Q-G之間。幾種可能性： 1. 載體上TEV識別的酶切序列發(fā)生突變，導致不能識別。建議：測序驗證一下； 2. TEV酶切位點序列正確，但是存在空間位阻，分兩種情況： 2.1 蛋白結構正確：酶切位點前面的MBP標簽和后面連的目的蛋白的空間結構影響了酶切位點的暴露，使TEV無法接觸識別。建議：可以嘗試在酶切位點與標簽之間添加Linker，拉長位點與MBP的距離。 2.2 最大的可能性，蛋白沒有復性成功，碰到好多人都誤以為蛋白從沉淀轉變?yōu)榭扇苄匀芤籂顟B(tài)就是復性成功了，實際上復性遠沒那么簡單。可溶性狀態(tài)可以是可溶性聚集體，也可以是多種不同構象的混合物，實現(xiàn)這種轉變太簡單了，但要將其結構歸一成完全正確的構象那才是最困難的，所以懷疑你的蛋白沒有折疊成功，而結構不對又影響了酶切位點的暴露，導致切不開。 |
4樓2020-08-21 17:02:55
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基因是讓別人合成的，反饋報告沒問題，中間也有了解linker.我是先在6M鹽酸胍中透析變性，再透析復性，全程沒有沉淀。我怎么知道我的蛋白復性成功沒？像我現(xiàn)在這樣，還有什么可以去嘗試的？謝謝 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2020-08-21 17:46:48
zsygxh
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有條件的話，拿透析后酶切前的樣品和鹽酸胍+還原劑徹底變性的樣品分別跑一下反相，比較一下出峰位置以及峰形，通常蛋白折疊后疏水側鏈折入分子內部，親水性增強，在反相上出峰位置會提前，如果透析后樣品能跑出較明顯的均一峰，那么有可能這個峰是復性成功的部分（也可能不是），但如果跑出來的峰沒有主峰，很雜亂，那么應該是復性失敗了，形成了眾多可溶性的雜亂構象及其聚集體。 如果有合適Maker的話，也可以跑一下Native-PAGE，看看是不是聚集體。如果目的蛋白含較多Cys，也可以嘗試跑還原-非還原電泳，看看是不是二硫鍵錯配產(chǎn)生的聚集體。有分子篩的話也可以跑一下看看有沒有聚集體。 如果沒復性成功，那只能根據(jù)蛋白性質摸方法，復性跟其它東西不一樣，沒有什么好的套路，只能根據(jù)蛋白的性質去相應設計復性條件，這個是沒辦法給你提供建議的。只能建議你分析一下一級序列，然后設計一些實驗去了解你蛋白的性質，分析它為什么會形成包涵體，然后反其道而行之，使用合適的方法、試劑對癥下藥進行優(yōu)化。 |
6樓2020-08-22 17:20:07
7樓2024-07-25 12:25:47
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