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~沙~新蟲 (初入文壇)
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TEV酶切mbp標(biāo)簽蛋白，切不開
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如題，蛋白變性復(fù)性以后依然切不開 @gyesang 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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zsygxh
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1 首先確認(rèn)一下TEV的酶切位點有沒有突變或其它問題 2 確認(rèn)一下是真的復(fù)性成功了還是只是形成了可溶性聚集體或其它非正確構(gòu)象的狀態(tài)？有測活性嗎？有活性的話，有跑HPLC看一下是否是一個均一峰嗎？ 3 確認(rèn)一下酶切溶液是否合適 4 以上都沒問題的話，可能是你的蛋白折疊后影響了酶切序列的暴露，由于存在空間位阻，TEV不能識別�？梢圆椴檫@個蛋白的結(jié)構(gòu)有沒有人解出來，有的話可以看看N端的空間結(jié)構(gòu)。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2020-08-20 14:35:18
~沙~
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3樓2020-08-21 13:30:38
zsygxh
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商業(yè)化的酶，按說明書的條件切的，默認(rèn)酶切體系沒問題，沒切出來，那么大概率是你的蛋白的問題了。TEV識別的位點是ENLYFQG，切在Q-G之間。幾種可能性： 1. 載體上TEV識別的酶切序列發(fā)生突變，導(dǎo)致不能識別。建議：測序驗證一下； 2. TEV酶切位點序列正確，但是存在空間位阻，分兩種情況： 2.1 蛋白結(jié)構(gòu)正確：酶切位點前面的MBP標(biāo)簽和后面連的目的蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響了酶切位點的暴露，使TEV無法接觸識別。建議：可以嘗試在酶切位點與標(biāo)簽之間添加Linker，拉長位點與MBP的距離。 2.2 最大的可能性，蛋白沒有復(fù)性成功，碰到好多人都誤以為蛋白從沉淀轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄匀芤籂顟B(tài)就是復(fù)性成功了，實際上復(fù)性遠(yuǎn)沒那么簡單�？扇苄誀顟B(tài)可以是可溶性聚集體，也可以是多種不同構(gòu)象的混合物，實現(xiàn)這種轉(zhuǎn)變太簡單了，但要將其結(jié)構(gòu)歸一成完全正確的構(gòu)象那才是最困難的，所以懷疑你的蛋白沒有折疊成功，而結(jié)構(gòu)不對又影響了酶切位點的暴露，導(dǎo)致切不開。 |
4樓2020-08-21 17:02:55
~沙~
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基因是讓別人合成的，反饋報告沒問題，中間也有了解linker.我是先在6M鹽酸胍中透析變性，再透析復(fù)性，全程沒有沉淀。我怎么知道我的蛋白復(fù)性成功沒？像我現(xiàn)在這樣，還有什么可以去嘗試的？謝謝 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2020-08-21 17:46:48
zsygxh
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有條件的話，拿透析后酶切前的樣品和鹽酸胍+還原劑徹底變性的樣品分別跑一下反相，比較一下出峰位置以及峰形，通常蛋白折疊后疏水側(cè)鏈折入分子內(nèi)部，親水性增強(qiáng)，在反相上出峰位置會提前，如果透析后樣品能跑出較明顯的均一峰，那么有可能這個峰是復(fù)性成功的部分（也可能不是），但如果跑出來的峰沒有主峰，很雜亂，那么應(yīng)該是復(fù)性失敗了，形成了眾多可溶性的雜亂構(gòu)象及其聚集體。 如果有合適Maker的話，也可以跑一下Native-PAGE，看看是不是聚集體。如果目的蛋白含較多Cys，也可以嘗試跑還原-非還原電泳，看看是不是二硫鍵錯配產(chǎn)生的聚集體。有分子篩的話也可以跑一下看看有沒有聚集體。 如果沒復(fù)性成功，那只能根據(jù)蛋白性質(zhì)摸方法，復(fù)性跟其它東西不一樣，沒有什么好的套路，只能根據(jù)蛋白的性質(zhì)去相應(yīng)設(shè)計復(fù)性條件，這個是沒辦法給你提供建議的。只能建議你分析一下一級序列，然后設(shè)計一些實驗去了解你蛋白的性質(zhì)，分析它為什么會形成包涵體，然后反其道而行之，使用合適的方法、試劑對癥下藥進(jìn)行優(yōu)化。 |
6樓2020-08-22 17:20:07
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