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WB/IHC/Elisa實驗封閉劑的種類及選擇 已有1人參與
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封閉的原理： 固相載體表面(如elisa板，NC膜或者PVDF膜上等)有很多孔洞，通過電轉(zhuǎn)或包被，膠上的蛋白被轉(zhuǎn)移到了膜上，或抗原/抗體固定在板上，蛋白以機械填補(堆積)和吸附的方式結合于表面。 蛋白塞進了表面的很多孔洞里面，但蛋白并不是連續(xù)的，有很多空隙，而且比如說樣品孔之間也有空隙，這些孔洞并沒有填進東西，而抗體也是蛋白，也會被吸附在空的洞里，這樣就會有很多非特異性的信號。 封閉液中的蛋白可以與表面上的空白空洞位置結合，同樣以機械填補(堆積)和吸附覆蓋的方式結合在膜上，因為有“填補”和“覆蓋”蛋白結合位點以避免一抗的非特異結合，所以有“封閉”的說法。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠很牢固的結合在空白位置上。這樣抗體蛋白就不會被非特異性的吸附到膜上，而只會跟特異性蛋白結合。 封閉劑應封閉所有的未結合位點而不替換表面上的靶蛋白、不結合靶蛋白表位、也不與抗體或檢測試劑有交叉反應。 封閉的目的 避免高背景和非特異性條帶 封閉所用試劑的選擇： 最常見的封閉劑是：BSA（牛血清白蛋白）、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠和Tween-20(0.05 - 0.1%)稀溶液PBST或者TBST。 1、 BSA BSA是最常用的封閉劑，成分單一適用于大多數(shù)情況。若免疫原是偶聯(lián)BSA的， BSA有很強的免疫原性，會導致產(chǎn)生很多的針對BSA的抗體，為避免交叉反應，不能用BSA、脫脂奶粉等封閉，可以選用酪蛋白或無蛋白的封閉劑封閉。 大部分BSA中有少量的抗體殘留，會導致抗原/抗體之間的交叉反應，產(chǎn)生高背景，雜帶較多或使得本底水平增高。 2、 血清 封閉血清的原理主要有兩點，第一是待檢樣本會有些與蛋白非特異性結合的物質(zhì)，從而導致背景過高，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分非特異性的結合，從這點看，BSA和血清沒有明顯區(qū)別。第二是待檢樣本中可能會有Fc受體，可以和抗體恒定區(qū)結合，與抗體特異性無關，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間結合。BSA則無法封閉Fc受體。 免疫組化中用血清封閉的較多。封閉血清一般選擇和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發(fā)生結合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結合， 會造成背景。但要注意封閉用血清中不能含有目標蛋白，且與一抗來源不同。另外二抗因盡量少選取兔子或老鼠來源的，因為這兩個在親緣關系上和人類非常接近，所以產(chǎn)生交叉反應的機會就比較大，從而導致背景比較高。適合選用來源于驢，山羊，綿羊等的二抗，背景相對就很低。 3、 脫脂奶粉 脫脂奶粉最大的優(yōu)點是價錢便宜，所以是首選，但是由于成分相對復雜，所以適用范圍要狹窄一些。磷酸化抗體也許會導致背景增加，此外，因為自身含有生物素,不能用于生物素標記的抗體系統(tǒng)。 奶粉蛋白種類比BSA多，而WB膜也好，ELISA板也好，表面的微結構都不是那么均勻的，相對而言，不同分子量蛋白種類多的奶粉(BSA只是一種蛋白)，封閉起來更全面。 脫脂奶粉中含有少量的生物素和堿性磷酸酶殘留，在使用生物素-親和素系統(tǒng)和堿性磷酸酶標記的二抗時，也會使得高背景或本底水平增高。 由于奶粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應用。 4、 酪蛋白 和BSA作用類似，普通酪蛋白不易溶解。中性和堿性條件下帶有負電性，與同樣帶負電荷膠體金之間存在排斥力，而膜一般都是帶正電荷，會與酪蛋白有一定的吸附作用，用酪蛋白封閉效果好些。 5、 無蛋白化合物 甲醛：與PVDF膜表面的微結構反應或者結合，使之失去結合蛋白的疏水力或者空間結構域。 去污劑(吐溫-20)：Tween-20是一種非離子型去污劑，有復性抗原的作用，與膜疏水性吸附，有很強的對非特異性吸附的洗脫作用，同樣可以降低蛋白間的疏水作用，可提高特異性的識別能力。在做westen blot時，用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉膜上的未結合位點可以降低抗體的非特異性結合。Tween 這種非離子型去污劑在乳化蛋白時，不破壞蛋白的結構，可減少對蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞。離子型去污劑如SDS則破壞蛋白的結構。 還有明膠，PEG等也可作為封閉劑。 封閉劑選擇的特殊情況： 1.脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標記的抗體一起使用，因為脫脂奶粉含有糖蛋白和生物素。 2.如果封閉劑中含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因為磷酸酶與印記膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化。 3.檢測磷酸化抗體時，不能使用酪蛋白/脫脂奶粉作為封閉劑。 一般封閉條件為： 室溫或者 37℃緩慢搖蕩1～2 h，特殊情況也可 4℃過夜。根據(jù)結果情況調(diào)整封閉試劑的濃度和類型。比如脫脂奶粉的封閉效果更強，但有時 BSA 比脫脂奶粉更有利于降低非特異性背景，而有些抗體則在脫脂奶粉封閉的情況下才能得到清晰的背景。 |
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2樓2020-08-14 08:38:12
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