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WB/IHC/Elisa實(shí)驗(yàn)封閉劑的種類及選擇 已有1人參與
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封閉的原理： 固相載體表面(如elisa板，NC膜或者PVDF膜上等)有很多孔洞，通過(guò)電轉(zhuǎn)或包被，膠上的蛋白被轉(zhuǎn)移到了膜上，或抗原/抗體固定在板上，蛋白以機(jī)械填補(bǔ)(堆積)和吸附的方式結(jié)合于表面。 蛋白塞進(jìn)了表面的很多孔洞里面，但蛋白并不是連續(xù)的，有很多空隙，而且比如說(shuō)樣品孔之間也有空隙，這些孔洞并沒(méi)有填進(jìn)東西，而抗體也是蛋白，也會(huì)被吸附在空的洞里，這樣就會(huì)有很多非特異性的信號(hào)。 封閉液中的蛋白可以與表面上的空白空洞位置結(jié)合，同樣以機(jī)械填補(bǔ)(堆積)和吸附覆蓋的方式結(jié)合在膜上，因?yàn)橛小疤钛a(bǔ)”和“覆蓋”蛋白結(jié)合位點(diǎn)以避免一抗的非特異結(jié)合，所以有“封閉”的說(shuō)法。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠很牢固的結(jié)合在空白位置上。這樣抗體蛋白就不會(huì)被非特異性的吸附到膜上，而只會(huì)跟特異性蛋白結(jié)合。 封閉劑應(yīng)封閉所有的未結(jié)合位點(diǎn)而不替換表面上的靶蛋白、不結(jié)合靶蛋白表位、也不與抗體或檢測(cè)試劑有交叉反應(yīng)。 封閉的目的 避免高背景和非特異性條帶 封閉所用試劑的選擇： 最常見(jiàn)的封閉劑是：BSA（牛血清白蛋白）、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠和Tween-20(0.05 - 0.1%)稀溶液PBST或者TBST。 1、 BSA BSA是最常用的封閉劑，成分單一適用于大多數(shù)情況。若免疫原是偶聯(lián)BSA的， BSA有很強(qiáng)的免疫原性，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生很多的針對(duì)BSA的抗體，為避免交叉反應(yīng)，不能用BSA、脫脂奶粉等封閉，可以選用酪蛋白或無(wú)蛋白的封閉劑封閉。 大部分BSA中有少量的抗體殘留，會(huì)導(dǎo)致抗原/抗體之間的交叉反應(yīng)，產(chǎn)生高背景，雜帶較多或使得本底水平增高。 2、 血清 封閉血清的原理主要有兩點(diǎn)，第一是待檢樣本會(huì)有些與蛋白非特異性結(jié)合的物質(zhì)，從而導(dǎo)致背景過(guò)高，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分非特異性的結(jié)合，從這點(diǎn)看，BSA和血清沒(méi)有明顯區(qū)別。第二是待檢樣本中可能會(huì)有Fc受體，可以和抗體恒定區(qū)結(jié)合，與抗體特異性無(wú)關(guān)，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間結(jié)合。BSA則無(wú)法封閉Fc受體。 免疫組化中用血清封閉的較多。封閉血清一般選擇和二抗同一來(lái)源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合， 會(huì)造成背景。但要注意封閉用血清中不能含有目標(biāo)蛋白，且與一抗來(lái)源不同。另外二抗因盡量少選取兔子或老鼠來(lái)源的，因?yàn)檫@兩個(gè)在親緣關(guān)系上和人類非常接近，所以產(chǎn)生交叉反應(yīng)的機(jī)會(huì)就比較大，從而導(dǎo)致背景比較高。適合選用來(lái)源于驢，山羊，綿羊等的二抗，背景相對(duì)就很低。 3、 脫脂奶粉 脫脂奶粉最大的優(yōu)點(diǎn)是價(jià)錢(qián)便宜，所以是首選，但是由于成分相對(duì)復(fù)雜，所以適用范圍要狹窄一些。磷酸化抗體也許會(huì)導(dǎo)致背景增加，此外，因?yàn)樽陨砗猩锼?不能用于生物素標(biāo)記的抗體系統(tǒng)。 奶粉蛋白種類比BSA多，而WB膜也好，ELISA板也好，表面的微結(jié)構(gòu)都不是那么均勻的，相對(duì)而言，不同分子量蛋白種類多的奶粉(BSA只是一種蛋白)，封閉起來(lái)更全面。 脫脂奶粉中含有少量的生物素和堿性磷酸酶殘留，在使用生物素-親和素系統(tǒng)和堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗時(shí)，也會(huì)使得高背景或本底水平增高。 由于奶粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長(zhǎng)期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。 4、 酪蛋白 和BSA作用類似，普通酪蛋白不易溶解。中性和堿性條件下帶有負(fù)電性，與同樣帶負(fù)電荷膠體金之間存在排斥力，而膜一般都是帶正電荷，會(huì)與酪蛋白有一定的吸附作用，用酪蛋白封閉效果好些。 5、 無(wú)蛋白化合物 甲醛：與PVDF膜表面的微結(jié)構(gòu)反應(yīng)或者結(jié)合，使之失去結(jié)合蛋白的疏水力或者空間結(jié)構(gòu)域。 去污劑(吐溫-20)：Tween-20是一種非離子型去污劑，有復(fù)性抗原的作用，與膜疏水性吸附，有很強(qiáng)的對(duì)非特異性吸附的洗脫作用，同樣可以降低蛋白間的疏水作用，可提高特異性的識(shí)別能力。在做westen blot時(shí)，用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉膜上的未結(jié)合位點(diǎn)可以降低抗體的非特異性結(jié)合。Tween 這種非離子型去污劑在乳化蛋白時(shí)，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，可減少對(duì)蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞。離子型去污劑如SDS則破壞蛋白的結(jié)構(gòu)。 還有明膠，PEG等也可作為封閉劑。 封閉劑選擇的特殊情況： 1.脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標(biāo)記的抗體一起使用，因?yàn)槊撝谭酆刑堑鞍缀蜕锼亍?br /> 2.如果封閉劑中含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因?yàn)榱姿崦概c印記膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化。 3.檢測(cè)磷酸化抗體時(shí)，不能使用酪蛋白/脫脂奶粉作為封閉劑。 一般封閉條件為： 室溫或者 37℃緩慢搖蕩1～2 h，特殊情況也可 4℃過(guò)夜。根據(jù)結(jié)果情況調(diào)整封閉試劑的濃度和類型。比如脫脂奶粉的封閉效果更強(qiáng)，但有時(shí) BSA 比脫脂奶粉更有利于降低非特異性背景，而有些抗體則在脫脂奶粉封閉的情況下才能得到清晰的背景。 |
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2樓2020-08-14 08:38:12
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