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由南往北木蟲 (正式寫手)
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[交流]
293T細(xì)胞蛋白胞內(nèi)表達(dá) 已有4人參與
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大家好， 我是剛剛接觸真核表達(dá)的小白一枚，由專業(yè)公司合成了一個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒，使用ptt5載體，打算使用293T細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。目的基因在NCBI上檢索發(fā)現(xiàn)序列自身不帶有信號(hào)肽，于是額外添加了一個(gè)適合在293T細(xì)胞分泌表達(dá)的信號(hào)肽；但是合成后的質(zhì)粒并不能分泌表達(dá)，在胞內(nèi)具有一定的表達(dá)量，所以當(dāng)時(shí)合成公司認(rèn)定此質(zhì)粒不能用于真核表達(dá)，為失敗�！驹摰鞍自吮磉_(dá)位包涵體，表達(dá)量lve低，但活性較好】 但是本人比較不信，于是收到“失敗”的質(zhì)粒后，我使用lipofectamine2000/3000分別進(jìn)行了293T轉(zhuǎn)染，使用雙抗夾心ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞上清中有微量表達(dá)，大概40ug/L，胞內(nèi)表達(dá)量相對(duì)較高，根據(jù)天然樣本的檢測(cè)推斷可能有40ug/10^5細(xì)胞（一個(gè)10cm平皿）。包涵體純化后蛋白質(zhì)活性較原核表達(dá)低至少8倍。 那么，問題來(lái)了： 1、為什么合成公司認(rèn)定胞內(nèi)表達(dá)即為失�。� 2、據(jù)我所了解的，基因信號(hào)肽主要作用是細(xì)胞內(nèi)定位，那么沒有信號(hào)肽說(shuō)明該蛋白沒有固定的表達(dá)位點(diǎn)？還是說(shuō)它本身就是屬于包涵體，不可作為分泌表達(dá)？ 3、額外添加了信號(hào)肽為什么不能使其分泌表達(dá)？ 4、真核胞內(nèi)表達(dá)的蛋白純化出來(lái)，經(jīng)過(guò)復(fù)性也會(huì)嚴(yán)重?fù)p失活性嗎？還是說(shuō)胞內(nèi)表達(dá)就已經(jīng)開始喪失活性？ 蛋白是想用來(lái)做免疫原的！ 感謝各位的談?wù)撝更c(diǎn)，望大家實(shí)驗(yàn)科研順利！ |
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分泌表達(dá)體系未分泌，認(rèn)為表達(dá)失敗沒問題，而且ELISA測(cè)分泌表達(dá)40ug 一般不認(rèn)為有表達(dá) 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2020-05-15 15:37:15
由南往北
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謝謝你！那么，某一個(gè)蛋白在胞內(nèi)表達(dá)也是可以的對(duì)吧，不能認(rèn)為胞內(nèi)表達(dá)就不可以（按我的理解，合成公司的意思是任何蛋白必須是分泌型，不存在包涵體） 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2020-05-15 18:32:26
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4樓2020-05-18 23:50:20
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6樓2020-05-21 11:53:30
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7樓2022-04-02 14:51:54
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