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congqian金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
重組桿狀病毒感染SF9細(xì)胞不表達(dá)目的蛋白
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各位同學(xué)，最近用重組桿狀病毒感染SF9細(xì)胞表達(dá)蛋白，但是遇到了一些問(wèn)題請(qǐng)教大家： 重組桿狀病毒是由生物公司合成提供的，經(jīng)qPCR驗(yàn)證含有目的基因片段。 1、SF9細(xì)胞28℃震蕩培養(yǎng)至1*10^6密度，重組桿狀病毒（P3代）按照MOI=0.1、5、20感染細(xì)胞。病毒感染SF9細(xì)胞以后，與陰性對(duì)照相比，細(xì)胞病變并不明顯，只有一點(diǎn)點(diǎn)變大，但是也不是很明顯，但是細(xì)胞明顯生長(zhǎng)變緩，細(xì)胞數(shù)基本不增加。病毒剛感染細(xì)胞和感染培養(yǎng)3天以后分別收獲上清經(jīng)qPCR驗(yàn)證，CT值縮小了10，是否可以確定病毒已經(jīng)成功感染細(xì)胞并且增值？ 2、蛋白是胞內(nèi)蛋白，感染3天以后離心沉淀經(jīng)RIP高效裂解液（索萊寶）裂解后進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯染色沒(méi)有目的蛋白條帶。與陽(yáng)性蛋白（外包公司合成并純化的蛋白）一起進(jìn)行WB，ECL顯色后，陽(yáng)性蛋白明顯有條帶，但是自己做的一點(diǎn)都沒(méi)有，是否說(shuō)明蛋白沒(méi)有表達(dá)？ 3、我把MOI做了0.1、5、10、20，SDS-PAGE結(jié)果都沒(méi)有蛋白條帶。 4、有沒(méi)有病毒本身成功感染并增殖，但是不表達(dá)蛋白的可能性？如果我要得到表達(dá)蛋白，應(yīng)該如何改進(jìn)我的實(shí)驗(yàn)條件？不表達(dá)蛋白的問(wèn)題可能是什么？謝謝！ |
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