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congqian金蟲 (小有名氣)
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[求助]
重組桿狀病毒感染SF9細胞不表達目的蛋白
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各位同學，最近用重組桿狀病毒感染SF9細胞表達蛋白，但是遇到了一些問題請教大家： 重組桿狀病毒是由生物公司合成提供的，經(jīng)qPCR驗證含有目的基因片段。 1、SF9細胞28℃震蕩培養(yǎng)至1*10^6密度，重組桿狀病毒（P3代）按照MOI=0.1、5、20感染細胞。病毒感染SF9細胞以后，與陰性對照相比，細胞病變并不明顯，只有一點點變大，但是也不是很明顯，但是細胞明顯生長變緩，細胞數(shù)基本不增加。病毒剛感染細胞和感染培養(yǎng)3天以后分別收獲上清經(jīng)qPCR驗證，CT值縮小了10，是否可以確定病毒已經(jīng)成功感染細胞并且增值？ 2、蛋白是胞內(nèi)蛋白，感染3天以后離心沉淀經(jīng)RIP高效裂解液（索萊寶）裂解后進行SDS-PAGE，考馬斯染色沒有目的蛋白條帶。與陽性蛋白（外包公司合成并純化的蛋白）一起進行WB，ECL顯色后，陽性蛋白明顯有條帶，但是自己做的一點都沒有，是否說明蛋白沒有表達？ 3、我把MOI做了0.1、5、10、20，SDS-PAGE結果都沒有蛋白條帶。 4、有沒有病毒本身成功感染并增殖，但是不表達蛋白的可能性？如果我要得到表達蛋白，應該如何改進我的實驗條件？不表達蛋白的問題可能是什么？謝謝！ |
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2樓2020-04-15 21:11:35
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3樓2020-04-15 21:12:26
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5樓2020-04-17 16:33:47
6樓2020-04-18 10:31:18
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我之前也遇到了，我用的His標簽，PAGE看不到帶，WB檢測不到條帶，后來是換的陽性血清抗體檢測才看到條帶，不知道你的是不是也是這個問題；對于PAGE看不到帶，通過提高病毒滴度，胞內(nèi)表達的蛋白在破碎后，沉淀可以看到條帶，WB檢測條帶也比較粗，不知道你的是否也存在這個問題 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2021-01-25 11:05:45
bachel201221
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通過對現(xiàn)有bac-to-bac系統(tǒng)進行改造，獲得敲除蛋白酶、敲除p26、p10等蛋白重組系統(tǒng)。并且，在該重組系統(tǒng)加入弱熒光標記及抗凋亡siRNA，可有效指示轉(zhuǎn)染過程、提高抗原表達量（尤其是分泌蛋白及囊膜蛋白）。感興趣的同志可以留言。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2021-05-17 14:41:22
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9樓2022-12-02 18:00:30
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