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mei1532467新蟲 (初入文壇)
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[求助]
考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量疑問(wèn)
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我在做固定化酶相關(guān)的課題，最近想使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定計(jì)算固定化后酶在載體上的負(fù)載量。結(jié)果實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有點(diǎn)反常理，無(wú)法解釋，麻煩各位幫忙分析一下，問(wèn)題出在哪里？ 我的具體方法是，1號(hào)加入緩沖溶液、酶液和交聯(lián)劑，2號(hào)加入未改性的原始載體、緩沖溶液、酶液和交聯(lián)劑，3號(hào)加入aptes改性載體、緩沖溶液、酶液和交聯(lián)劑，進(jìn)行固定化反應(yīng)，1、2、3號(hào)中所有加入的液體體積都是相同的。 固定化結(jié)束后，使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定對(duì)比1、2、3號(hào)上清液中蛋白質(zhì)含量。具體過(guò)程是，分別在試管中加入8ml考馬斯亮藍(lán)試劑和2ml上清液，2分鐘后在595nm處測(cè)定吸光度，使用8ml考馬斯亮藍(lán)試劑和2ml緩沖溶液的混合液作為參比對(duì)照。事先使用待測(cè)蛋白質(zhì)做了標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2能達(dá)到2個(gè)9以上。 結(jié)果：3號(hào)上清液的蛋白含量是1號(hào)的3倍多，1號(hào)上清液中蛋白含量比2號(hào)高一點(diǎn)。特別是1號(hào)和3號(hào)對(duì)比，也就是說(shuō)固定化后，上清液中蛋白含量沒(méi)有減少，反而平白無(wú)故的增多了很多，這沒(méi)法解釋。 上清液往考馬斯亮藍(lán)試劑中加入的時(shí)候，肉眼就能看出差別，3號(hào)混合液馬上變得非常藍(lán)，而1號(hào)混合液的顏色變化不明顯。1號(hào)上清液中蛋白含量的測(cè)定值，跟蛋白質(zhì)稱量溶解稀釋后的計(jì)算值基本吻合，也就是說(shuō)1號(hào)的測(cè)量值沒(méi)問(wèn)題的，但是3號(hào)經(jīng)過(guò)固定化后，上清液中蛋白含量不減少，反而大幅增大，實(shí)在是有問(wèn)題。我知道肯定是有地方出錯(cuò)了，但是我實(shí)在找不出原因，求助各位請(qǐng)幫忙分析一下，問(wèn)題究竟出在哪里，謝謝了！ 我也是第一次使用考馬斯亮藍(lán)法，也有幾點(diǎn)疑問(wèn)望各位一并解答，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我偶然間使用大量的緩沖溶液稀釋考馬斯亮藍(lán)試劑，發(fā)現(xiàn)混合液馬上變藍(lán)，跟加入蛋白質(zhì)一樣，并且緩沖溶液ph越高，顏色就越藍(lán)，這正常嗎？還有考馬斯亮藍(lán)試劑應(yīng)該是什么顏色的呢？我配制的是黑褐色，使用8ml考馬斯亮藍(lán)和2ml緩沖溶液配制參比液時(shí)混合液變成了暗綠色，當(dāng)加入蛋白質(zhì)時(shí)，會(huì)變成藍(lán)色，這正常嗎？ 謝謝！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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3樓2021-05-10 11:18:59
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2樓2021-05-10 11:15:00
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