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mei1532467新蟲 (初入文壇)
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[求助]
考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量疑問
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我在做固定化酶相關(guān)的課題，最近想使用考馬斯亮藍(lán)法測定計算固定化后酶在載體上的負(fù)載量。結(jié)果實驗數(shù)據(jù)有點反常理，無法解釋，麻煩各位幫忙分析一下，問題出在哪里？ 我的具體方法是，1號加入緩沖溶液、酶液和交聯(lián)劑，2號加入未改性的原始載體、緩沖溶液、酶液和交聯(lián)劑，3號加入aptes改性載體、緩沖溶液、酶液和交聯(lián)劑，進行固定化反應(yīng)，1、2、3號中所有加入的液體體積都是相同的。 固定化結(jié)束后，使用考馬斯亮藍(lán)法測定對比1、2、3號上清液中蛋白質(zhì)含量。具體過程是，分別在試管中加入8ml考馬斯亮藍(lán)試劑和2ml上清液，2分鐘后在595nm處測定吸光度，使用8ml考馬斯亮藍(lán)試劑和2ml緩沖溶液的混合液作為參比對照。事先使用待測蛋白質(zhì)做了標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2能達(dá)到2個9以上。 結(jié)果：3號上清液的蛋白含量是1號的3倍多，1號上清液中蛋白含量比2號高一點。特別是1號和3號對比，也就是說固定化后，上清液中蛋白含量沒有減少，反而平白無故的增多了很多，這沒法解釋。 上清液往考馬斯亮藍(lán)試劑中加入的時候，肉眼就能看出差別，3號混合液馬上變得非常藍(lán)，而1號混合液的顏色變化不明顯。1號上清液中蛋白含量的測定值，跟蛋白質(zhì)稱量溶解稀釋后的計算值基本吻合，也就是說1號的測量值沒問題的，但是3號經(jīng)過固定化后，上清液中蛋白含量不減少，反而大幅增大，實在是有問題。我知道肯定是有地方出錯了，但是我實在找不出原因，求助各位請幫忙分析一下，問題究竟出在哪里，謝謝了！ 我也是第一次使用考馬斯亮藍(lán)法，也有幾點疑問望各位一并解答，實驗過程中我偶然間使用大量的緩沖溶液稀釋考馬斯亮藍(lán)試劑，發(fā)現(xiàn)混合液馬上變藍(lán)，跟加入蛋白質(zhì)一樣，并且緩沖溶液ph越高，顏色就越藍(lán)，這正常嗎？還有考馬斯亮藍(lán)試劑應(yīng)該是什么顏色的呢？我配制的是黑褐色，使用8ml考馬斯亮藍(lán)和2ml緩沖溶液配制參比液時混合液變成了暗綠色，當(dāng)加入蛋白質(zhì)時，會變成藍(lán)色，這正常嗎？ 謝謝！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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2樓2021-05-10 11:15:00
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3樓2021-05-10 11:18:59
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