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yedansky新蟲 (著名寫手)
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[交流]
蛋白可溶性表達(dá) 無(wú)活性
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有沒(méi)有可能 大腸桿菌在OD600 0.4-0.6 誘導(dǎo)時(shí)，少量表達(dá)的可溶性蛋白 有很高的活性 但OD600 值在0.7-0.8或者更高，雖然為可溶性表達(dá)，但是無(wú)活性，有人有這種情況么 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2020-01-18 20:29:00
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2020-01-18 20:29:00
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可能有難度。大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)是還原環(huán)境，缺乏二硫鍵形成和異構(gòu)的相關(guān)酶類，所以在胞內(nèi)表達(dá)的蛋白是還原狀態(tài)的，破菌后氧化形成二硫鍵的過(guò)程是隨機(jī)的，也就會(huì)出現(xiàn)大量的分子內(nèi)及分子間的錯(cuò)配交聯(lián)。另外像鋅指結(jié)構(gòu)蛋白中cys不參與二硫鍵形成，而是與金屬離子形成配位鍵，穩(wěn)固空間結(jié)構(gòu)的。如果這個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)已經(jīng)有人解出來(lái)的話，先明確一下cys的配對(duì)情況或空間位置。多cys的蛋白往往比較難做，可能會(huì)是持久戰(zhàn)。建議嘗試TrxB和gor基因突變的菌株表達(dá)，比如origami，rosetta-gami系列的菌株，或者嘗試分泌表達(dá)，或真核宿主表達(dá)，實(shí)在不行就嘗試復(fù)性。 |
5樓2020-01-10 22:31:30
旭日讀書
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2樓2020-01-10 16:01:09
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
西門吹雪170: 金幣+5, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2020-01-18 20:28:23
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
西門吹雪170: 金幣+5, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2020-01-18 20:28:23
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關(guān)系應(yīng)該不大。 1. 首先蛋白可溶并不代表蛋白處于天然結(jié)構(gòu)，它可以是可溶性多聚體，也可以是多種結(jié)構(gòu)的混合物，雖然沒(méi)有沉淀，但有可能活性位點(diǎn)被包埋或活性位點(diǎn)的氨基酸側(cè)鏈空間位置變化而沒(méi)有活性，這跟蛋白性質(zhì)有關(guān)，所以即使可溶活性也可能很低甚至無(wú)活性。 2. 蛋白可能存在必要的修飾才有活性，原核表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法完成，查文獻(xiàn)自行確認(rèn)。 3. 缺乏輔因子，查文獻(xiàn)自行確認(rèn)。 建議純化以后跑一下HPLC，先確認(rèn)樣品是否為單一結(jié)構(gòu)。另外，確認(rèn)一下序列里有沒(méi)有cys，如果有確認(rèn)cys是形成二硫鍵還是參與金屬離子配位的，如果沒(méi)有嘗試融合不同標(biāo)簽表達(dá)。 總之，優(yōu)先嘗試通過(guò)可溶表達(dá)獲得天然構(gòu)象的蛋白，不行嘗試復(fù)性。 |
3樓2020-01-10 17:09:02
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4樓2020-01-10 19:41:40
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