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細胞轉(zhuǎn)染實驗注意事項之質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的選擇
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有的初學(xué)者習(xí)慣按照說明書123地去操作而不求甚解，你“知其然”是否還“知其所以然”呢？ 啟動子的選擇對于轉(zhuǎn)染基因的有效表達是非常重要的。對于轉(zhuǎn)染過程本身雖然無甚影響，但是對轉(zhuǎn)染結(jié)果卻有著微妙的影響。 如果你的目的基因正好會影響選定細胞株的生長，甚至有毒，那最好選擇一個誘導(dǎo)型的啟動子，不然你可能總是轉(zhuǎn)染不了。但是通常在實驗之前我們不清楚我們研究的基因產(chǎn)物是否對選定的細胞有毒，所以正負對照很重要。當(dāng)排除其他原因后轉(zhuǎn)染總是失敗，應(yīng)當(dāng)從根本上考慮原因。 質(zhì)粒的大小和質(zhì)量: 線性化還是超螺旋會影響轉(zhuǎn)染結(jié)果：超螺旋質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率比線性DNA高得多，特別是瞬時轉(zhuǎn)染。而線性化DNA轉(zhuǎn)染的整合幾率高。質(zhì)粒太大了轉(zhuǎn)染會困難一些。畢竟，相對致密、較小的外源異物被細胞內(nèi)吞的幾率要大一些。如果你的質(zhì)粒正好比較大，又沒有經(jīng)驗，選擇特別注明可以轉(zhuǎn)大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染試劑成功幾率會高一些。有的轉(zhuǎn)染試劑還會提供一些促進DNA凝聚的成分，使得DNA形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物時更致密一些，更容易轉(zhuǎn)染一些。 純化質(zhì)粒的質(zhì)量無疑會影響轉(zhuǎn)染效率。哺乳動物細胞總歸是比大腸桿菌嬌氣，轉(zhuǎn)染難度高些，因而要求的DNA純度要更高些。早年要做轉(zhuǎn)染真是大陣仗啊，光是提質(zhì)粒做超離就令人皺眉。最令人頭疼的是內(nèi)毒素了。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上特有的成分，主要是脂多糖中的類脂A（lipopolysaccharides），在細菌被裂解時被釋放出來，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)和特性，在質(zhì)粒提取的過程中內(nèi)毒素很容易混入質(zhì)粒DNA中共同純化出來。內(nèi)毒素的存在會嚴(yán)重地影響轉(zhuǎn)染效率，此外內(nèi)毒素可能會激活造血細胞（例如B細胞、巨嗜細胞等）的非特異免疫反應(yīng)，造成實驗中的假陽性。所以質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染時應(yīng)盡量采用無內(nèi)毒素污染的超純質(zhì)粒。幸好技術(shù)的進步令復(fù)雜的操作成為過去，多數(shù)實驗室會選擇使用轉(zhuǎn)染級別的質(zhì)粒純化試劑盒純化的質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染。對于一些“耐受性高、容易操作的”細胞株，普通的Kit已經(jīng)夠了。對于一些對內(nèi)毒素特別敏感的細胞，就要用“去內(nèi)毒素”的質(zhì)粒純化Kit了。 質(zhì)粒DNA的濃度和量： 既然質(zhì)粒純化已經(jīng)不成問題，初學(xué)者通常都不會在乎甚至愿意多加點DNA，但是要注意的是，DNA量過少固然轉(zhuǎn)染效率不高，DNA量過多同樣會降低轉(zhuǎn)染效率。 DNA:轉(zhuǎn)染試劑的比例的優(yōu)化是非常重要的，特別是對于陽離子脂質(zhì)體、多胺等帶電荷的轉(zhuǎn)染試劑來說，DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物所帶的凈電荷是由轉(zhuǎn)染試劑和DNA的比例決定的，而轉(zhuǎn)染復(fù)合物是否能更好地結(jié)合到帶負電的細胞膜上，很大程度取決于這個凈電荷。所以預(yù)實驗需要按照說明書的要求，按一定比例混合適量的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑。 有的轉(zhuǎn)染試劑要求DNA的量多些，有的轉(zhuǎn)染試劑效率高只要很少DNA。所以轉(zhuǎn)染前最好能精確定量質(zhì)粒。另外由于質(zhì)粒本身的因素（比如目的基因產(chǎn)物是否有毒、啟動子強弱等因素），單獨DNA也會對細胞生長有一個基礎(chǔ)的影響，所以同時做幾組不同量的對照實驗進行優(yōu)化是很有幫助的。另外值得注意的是，當(dāng)細胞鋪板密度較高時，需要的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑的量也會略微提高。 RFect Plasmid DNA Transfection Reagent具有非常卓越的轉(zhuǎn)染性能，可高效轉(zhuǎn)染多種貼壁細胞、原代細胞和懸浮細胞，轉(zhuǎn)染效率在貼壁細胞中高達90%以上（EGFP質(zhì)粒）。RFect Plasmid 不僅可轉(zhuǎn)染較大分子的質(zhì)粒DNA，還可轉(zhuǎn)染RNA和小分子DNA。與目前市場上常見的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑不同，RFect Plasmid 采用生物可降解材料配制，對細胞的毒性很低，轉(zhuǎn)染后細胞死亡率不到10%。RFect Plasmid 使用也非常方便，先將轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒DNA混合，再將轉(zhuǎn)染試劑-DNA復(fù)合物直接加入培養(yǎng)細胞中，血清不影響其轉(zhuǎn)染效果，不必刻意添加或更換培養(yǎng)液，操作十分簡便。 |
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