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[交流] 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)之質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的選擇

有的初學(xué)者習(xí)慣按照說(shuō)明書123地去操作而不求甚解，你“知其然”是否還“知其所以然”呢？

啟動(dòng)子的選擇對(duì)于轉(zhuǎn)染基因的有效表達(dá)是非常重要的。對(duì)于轉(zhuǎn)染過程本身雖然無(wú)甚影響，但是對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果卻有著微妙的影響。

如果你的目的基因正好會(huì)影響選定細(xì)胞株的生長(zhǎng)，甚至有毒，那最好選擇一個(gè)誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子，不然你可能總是轉(zhuǎn)染不了。但是通常在實(shí)驗(yàn)之前我們不清楚我們研究的基因產(chǎn)物是否對(duì)選定的細(xì)胞有毒，所以正負(fù)對(duì)照很重要。當(dāng)排除其他原因后轉(zhuǎn)染總是失敗，應(yīng)當(dāng)從根本上考慮原因。

質(zhì)粒的大小和質(zhì)量:

線性化還是超螺旋會(huì)影響轉(zhuǎn)染結(jié)果：超螺旋質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率比線性DNA高得多，特別是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。而線性化DNA轉(zhuǎn)染的整合幾率高。質(zhì)粒太大了轉(zhuǎn)染會(huì)困難一些。畢竟，相對(duì)致密、較小的外源異物被細(xì)胞內(nèi)吞的幾率要大一些。如果你的質(zhì)粒正好比較大，又沒有經(jīng)驗(yàn)，選擇特別注明可以轉(zhuǎn)大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染試劑成功幾率會(huì)高一些。有的轉(zhuǎn)染試劑還會(huì)提供一些促進(jìn)DNA凝聚的成分，使得DNA形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)更致密一些，更容易轉(zhuǎn)染一些。

純化質(zhì)粒的質(zhì)量無(wú)疑會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。哺乳動(dòng)物細(xì)胞總歸是比大腸桿菌嬌氣，轉(zhuǎn)染難度高些，因而要求的DNA純度要更高些。早年要做轉(zhuǎn)染真是大陣仗啊，光是提質(zhì)粒做超離就令人皺眉。最令人頭疼的是內(nèi)毒素了。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上特有的成分，主要是脂多糖中的類脂A（lipopolysaccharides），在細(xì)菌被裂解時(shí)被釋放出來(lái)，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)和特性，在質(zhì)粒提取的過程中內(nèi)毒素很容易混入質(zhì)粒DNA中共同純化出來(lái)。內(nèi)毒素的存在會(huì)嚴(yán)重地影響轉(zhuǎn)染效率，此外內(nèi)毒素可能會(huì)激活造血細(xì)胞（例如B細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞等）的非特異免疫反應(yīng)，造成實(shí)驗(yàn)中的假陽(yáng)性。所以質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)盡量采用無(wú)內(nèi)毒素污染的超純質(zhì)粒。幸好技術(shù)的進(jìn)步令復(fù)雜的操作成為過去，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室會(huì)選擇使用轉(zhuǎn)染級(jí)別的質(zhì)粒純化試劑盒純化的質(zhì)粒來(lái)轉(zhuǎn)染。對(duì)于一些“耐受性高、容易操作的”細(xì)胞株，普通的Kit已經(jīng)夠了。對(duì)于一些對(duì)內(nèi)毒素特別敏感的細(xì)胞，就要用“去內(nèi)毒素”的質(zhì)粒純化Kit了。

質(zhì)粒DNA的濃度和量：

既然質(zhì)粒純化已經(jīng)不成問題，初學(xué)者通常都不會(huì)在乎甚至愿意多加點(diǎn)DNA，但是要注意的是，DNA量過少固然轉(zhuǎn)染效率不高，DNA量過多同樣會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率。

DNA:轉(zhuǎn)染試劑的比例的優(yōu)化是非常重要的，特別是對(duì)于陽(yáng)離子脂質(zhì)體、多胺等帶電荷的轉(zhuǎn)染試劑來(lái)說(shuō)，DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物所帶的凈電荷是由轉(zhuǎn)染試劑和DNA的比例決定的，而轉(zhuǎn)染復(fù)合物是否能更好地結(jié)合到帶負(fù)電的細(xì)胞膜上，很大程度取決于這個(gè)凈電荷。所以預(yù)實(shí)驗(yàn)需要按照說(shuō)明書的要求，按一定比例混合適量的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑。

有的轉(zhuǎn)染試劑要求DNA的量多些，有的轉(zhuǎn)染試劑效率高只要很少DNA。所以轉(zhuǎn)染前最好能精確定量質(zhì)粒。另外由于質(zhì)粒本身的因素（比如目的基因產(chǎn)物是否有毒、啟動(dòng)子強(qiáng)弱等因素），單獨(dú)DNA也會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一個(gè)基礎(chǔ)的影響，所以同時(shí)做幾組不同量的對(duì)照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化是很有幫助的。另外值得注意的是，當(dāng)細(xì)胞鋪板密度較高時(shí)，需要的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑的量也會(huì)略微提高。

RFect Plasmid DNA Transfection Reagent具有非常卓越的轉(zhuǎn)染性能，可高效轉(zhuǎn)染多種貼壁細(xì)胞、原代細(xì)胞和懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率在貼壁細(xì)胞中高達(dá)90%以上（EGFP質(zhì)粒）。RFect Plasmid 不僅可轉(zhuǎn)染較大分子的質(zhì)粒DNA，還可轉(zhuǎn)染RNA和小分子DNA。與目前市場(chǎng)上常見的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑不同，RFect Plasmid 采用生物可降解材料配制，對(duì)細(xì)胞的毒性很低，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡率不到10%。RFect Plasmid 使用也非常方便，先將轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒DNA混合，再將轉(zhuǎn)染試劑-DNA復(fù)合物直接加入培養(yǎng)細(xì)胞中，血清不影響其轉(zhuǎn)染效果，不必刻意添加或更換培養(yǎng)液，操作十分簡(jiǎn)便。

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1樓 2019-11-21 11:00:13

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天根小提中量試劑盒，提取內(nèi)毒素含量高嗎，對(duì)原代細(xì)胞損害怎樣？

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6樓2020-10-12 01:36:49

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