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chongmumu新蟲 (初入文壇)
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[求助]
使用超聲破碎細(xì)胞提取膜蛋白，破碎時(shí)間多久合適？ 已有1人參與
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最近在做UGT等位基因重組酶活性的實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)在的問(wèn)題重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，超聲破碎細(xì)胞提取蛋白分別進(jìn)行WB和體外孵育實(shí)驗(yàn)，WB能看到蛋白表達(dá)，但是體外孵育后進(jìn)行HPLC檢測(cè)，無(wú)論如何都檢測(cè)不到代謝峰，孵育體系是參照文獻(xiàn)來(lái)的，陽(yáng)性對(duì)照能看到代謝峰，全程也都是在冰上操作，現(xiàn)在懷疑是我的酶在破碎時(shí)就降解了。 超聲破碎時(shí)間文獻(xiàn)上給的差異非常大，總結(jié)了一下大概有三種： 1.工作3s，冷卻休息1min，振幅70%，總時(shí)間2min 2.工作5-8s，冷卻休息10-20s，3-5個(gè)循環(huán) 3.工作30s，冷卻休息1min，3個(gè)循環(huán) 想問(wèn)問(wèn)大家以上三種方法哪個(gè)可行呢？ 前兩個(gè)和第三個(gè)的工作時(shí)間差的有點(diǎn)多，第三篇是外文文獻(xiàn)原話是 prepared by sonication of cells in10mM Tris buffer for three30-s bursts, each separated by a 1-min cooling on ice，是不是我理解的有問(wèn)題…… 我之前參考的第一種，單位的超聲破碎儀型號(hào)比較老，不能設(shè)置振幅，我進(jìn)行了4個(gè)循環(huán)，有沒(méi)有哪位大神知道這鐘老式型號(hào)的超聲波破碎儀振幅怎么能控制呢？請(qǐng)有經(jīng)驗(yàn)的大家?guī)蛶兔Γ〔粍俑屑ぃ≈x謝！  |
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2樓2019-10-21 17:28:32
chongmumu
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3樓2019-10-22 16:03:10
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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樓主你好，我自己做植物線粒體膜蛋白研究。我做過(guò)線粒體膜蛋白的超生分離。 根據(jù)你的描述，我認(rèn)為如果WB能檢測(cè)到你的目的蛋白表達(dá)，那說(shuō)明你的超聲步驟問(wèn)題不大，有可能是在體外孵育的步驟發(fā)生了蛋白質(zhì)降解。可以加一些蛋白酶抑制劑如Protease Inhibitor cocktails或者PMSF（注意，PMSF在水基容液中的穩(wěn)定性很差，半衰期很短，時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)降解）。 如果你還是擔(dān)心超聲有問(wèn)題，可以在你的超聲Buffer里加入上述蛋白酶抑制劑。 超聲參數(shù)其實(shí)是因儀器而異的。如果使用的不是同樣的儀器，只能起參考作用。 并且，關(guān)于超聲功率的問(wèn)題，是和你所用的超聲探頭有關(guān)。 超聲過(guò)程對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的主要影響就是發(fā)熱，可以適當(dāng)增加在冰上冷卻暫停的時(shí)間并減少一次超聲的時(shí)長(zhǎng)。 而且，最好超聲的過(guò)程中讓樣品一直在冰上。 如果你超聲過(guò)程中樣品一直起沫，那是由于你的樣品體積相對(duì)于你使用的超聲功率來(lái)說(shuō)太小。 可以先用1 mg/ml 的BSA水溶液進(jìn)行測(cè)試，找到最適合你目前使用的超聲儀的容液體積。 而且，你的樣品最好也稀釋到mg/ml的濃度進(jìn)行超聲。 預(yù)祝試驗(yàn)成功，有問(wèn)題歡迎討論  |
4樓2019-10-23 20:31:00
Fishsh
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超聲破碎時(shí)探頭附近能量釋放高且不穩(wěn)定，產(chǎn)熱較多，建議試一下UH-03高壓破碎機(jī)方式，做膜蛋白的很多人都用  發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
5樓2019-12-11 11:31:05
bio-boy
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6樓2020-01-27 08:06:14
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