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[求助]
使用超聲破碎細胞提取膜蛋白，破碎時間多久合適？ 已有1人參與
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最近在做UGT等位基因重組酶活性的實驗，現(xiàn)在的問題重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后，超聲破碎細胞提取蛋白分別進行WB和體外孵育實驗，WB能看到蛋白表達，但是體外孵育后進行HPLC檢測，無論如何都檢測不到代謝峰，孵育體系是參照文獻來的，陽性對照能看到代謝峰，全程也都是在冰上操作，現(xiàn)在懷疑是我的酶在破碎時就降解了。 超聲破碎時間文獻上給的差異非常大，總結(jié)了一下大概有三種： 1.工作3s，冷卻休息1min，振幅70%，總時間2min 2.工作5-8s，冷卻休息10-20s，3-5個循環(huán) 3.工作30s，冷卻休息1min，3個循環(huán) 想問問大家以上三種方法哪個可行呢？ 前兩個和第三個的工作時間差的有點多，第三篇是外文文獻原話是 prepared by sonication of cells in10mM Tris buffer for three30-s bursts, each separated by a 1-min cooling on ice，是不是我理解的有問題…… 我之前參考的第一種，單位的超聲破碎儀型號比較老，不能設(shè)置振幅，我進行了4個循環(huán)，有沒有哪位大神知道這鐘老式型號的超聲波破碎儀振幅怎么能控制呢？請有經(jīng)驗的大家?guī)蛶兔�！不勝感激！謝謝！  |
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歡迎211本科同學，過A區(qū)國家線，A區(qū)非偏遠一本，交叉學科課題組
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2樓2019-10-21 17:28:32
3樓2019-10-22 16:03:10
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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樓主你好，我自己做植物線粒體膜蛋白研究。我做過線粒體膜蛋白的超生分離。 根據(jù)你的描述，我認為如果WB能檢測到你的目的蛋白表達，那說明你的超聲步驟問題不大，有可能是在體外孵育的步驟發(fā)生了蛋白質(zhì)降解�？梢约右恍┑鞍酌敢种苿┤鏟rotease Inhibitor cocktails或者PMSF（注意，PMSF在水基容液中的穩(wěn)定性很差，半衰期很短，時間長了會降解）。 如果你還是擔心超聲有問題，可以在你的超聲Buffer里加入上述蛋白酶抑制劑。 超聲參數(shù)其實是因儀器而異的。如果使用的不是同樣的儀器，只能起參考作用。 并且，關(guān)于超聲功率的問題，是和你所用的超聲探頭有關(guān)。 超聲過程對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的主要影響就是發(fā)熱，可以適當增加在冰上冷卻暫停的時間并減少一次超聲的時長。 而且，最好超聲的過程中讓樣品一直在冰上。 如果你超聲過程中樣品一直起沫，那是由于你的樣品體積相對于你使用的超聲功率來說太小。 可以先用1 mg/ml 的BSA水溶液進行測試，找到最適合你目前使用的超聲儀的容液體積。 而且，你的樣品最好也稀釋到mg/ml的濃度進行超聲。 預祝試驗成功，有問題歡迎討論  |
4樓2019-10-23 20:31:00
Fishsh
新蟲 (初入文壇)
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5樓2019-12-11 11:31:05
bio-boy
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6樓2020-01-27 08:06:14
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