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WB實(shí)驗(yàn)總做不好，那么如何進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)質(zhì)控呢？ 已有2人參與
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做過WB實(shí)驗(yàn)的小伙伴都經(jīng)歷過成像時(shí)忐忑不安，出來結(jié)果時(shí)的彷徨無措，為什么條帶沒有出啦，為什么背景這么高，為什么受傷的總是我，看著旁邊小伙伴漂亮的結(jié)果圖，心生羨慕嫉妒，那么小編給大家整理總結(jié)了如何進(jìn)行WB的質(zhì)控和注意哪些檢查點(diǎn)。 蛋白樣品： 準(zhǔn)備好裂解液后，使用BCA或Bradford等檢測方法仔細(xì)測量蛋白濃度。進(jìn)行上樣時(shí)，確保加入等量的蛋白樣品，以確保公平比較，從而最大限度地減少上樣誤差。不要使凝膠過載！如果您的表達(dá)目標(biāo)非常低，可選擇加樣孔體積大的凝膠，這樣可提高上樣量。 陽性和陰性對照： 這些質(zhì)控對于證明您的結(jié)果有效至關(guān)重要。陽性對照通常是裂解物或組織提取物，其具有過度表達(dá)的蛋白。當(dāng)您的陽性對照未能發(fā)出信號時(shí)，您知道該方法可能存在問題。如果您正在使用重組蛋白，那么包含內(nèi)源形式靶標(biāo)的陽性對照也是一個(gè)好主意。這將有助于理清與一抗相關(guān)的任何特異性問題。陰性對照同樣也有價(jià)值，通常是不會產(chǎn)生目標(biāo)的裂解物或組織提取物。最好的陰性對照由敲除或未處理的細(xì)胞系制備。 內(nèi)參對照： 有幾種廣泛可用的上樣對照抗體，如GAPDH，actin 或 tubulin。由于這些蛋白表達(dá)豐度高，因此在適應(yīng)低豐度目標(biāo)的樣品表達(dá)看到內(nèi)參對照蛋白的過飽非常常見。這里最大的挑戰(zhàn)是內(nèi)參對照和靶蛋白在相同的樣品稀釋系列中通常具有不同的線性，影響定量的準(zhǔn)確性，對于目的蛋白表達(dá)比較低的蛋白，可選擇低表達(dá)的內(nèi)參例如Lamin B1和HSP60等蛋白。此外，研究人員需要證明內(nèi)參蛋白的表達(dá)不會因?qū)嶒?yàn)條件的變化而改變。 |
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2019-10-15 11:33:47, 167.29 K
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