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格桑梅朵lwy新蟲 (小有名氣)
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[求助]
做NF-KB通路，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中蛋白提取 不太懂啊，求助大神��！ 已有1人參與
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我想做動(dòng)物組織的NF-kB通路，請(qǐng)問這個(gè)也可以既做細(xì)胞質(zhì)又做細(xì)胞核中的蛋白WB嗎？查文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)大家細(xì)胞這樣做的比較多一些，不知道動(dòng)物組織是否也可以這么做？ NF-kB需要從胞漿中轉(zhuǎn)到細(xì)胞核中，才能引發(fā)轉(zhuǎn)錄，生成某些因子 |
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wanghm200810
鐵蟲 (小有名氣)
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- 蟲號(hào): 7022336
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- 性別: MM
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
【答案】應(yīng)助回帖
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動(dòng)物組織的也可以，算體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞的算體外實(shí)驗(yàn)。上升一個(gè)層級(jí)。組織胞質(zhì)胞核分離你可以看看這個(gè) MinuteTM新鮮/冷凍組織胞質(zhì)胞核分離試劑盒 目錄號(hào)：NT-032 描述： 從細(xì)胞和組織中分離細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核組分是一種常見的實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞樣品的組分分離相對(duì)簡(jiǎn)單直接，然而，從組織樣品中特別是冷凍組織中將胞質(zhì)和胞核組分分離干凈是很具挑戰(zhàn)的。因?yàn)槔鋬龊头磸?fù)凍融會(huì)引起組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變，加之不適當(dāng)?shù)膭驖{方式和效率低的提取緩沖液，使得交叉污染十分嚴(yán)重。目前大多數(shù)商業(yè)試劑盒設(shè)計(jì)可同時(shí)用于細(xì)胞和組織樣品，但是忽略了兩種類型樣品之間的結(jié)構(gòu)差異。因此，從新鮮/冷凍組織中分離胞質(zhì)和胞核組分時(shí)，交叉污染問題無法避免(見下文參考文獻(xiàn)1和2)。這款新型的胞質(zhì)和胞核分離試劑盒專用于組織樣品的胞質(zhì)胞核分離，試劑盒特有的緩沖液體系和獨(dú)特的操作方法可以將交叉污染降到最低。整個(gè)操作可以在30分鐘內(nèi)完成。 應(yīng)用： 可應(yīng)用于SDS-PAGE，immunoblottings，ELISA，IP，蛋白定位，凝膠遷移分析，2-D等其他應(yīng)用。 試劑盒組分 1.緩沖液A 25ml 2.緩沖液B 10ml 3.緩沖液D 1.5ml 4.緩沖液N 1.5ml 5.1.5ml離心管 40個(gè) 6.1.5ml研磨杵 2個(gè) 7.蛋白質(zhì)提取粉 2克 運(yùn)輸：常溫運(yùn)輸 儲(chǔ)存：常溫保存 重要產(chǎn)品信息 1. 實(shí)驗(yàn)開始前將緩沖液A和緩沖液B冰上預(yù)冷。 2. 所有的離心步驟請(qǐng)使用4度或冷凍離心機(jī)。 3. 使用前推薦將蛋白酶抑制劑加入分裝的緩沖液A中。 4. 研究蛋白磷酸化，磷酸酶抑制劑應(yīng)在使用前加入分裝的緩沖液A和緩沖液B中。 5. 推薦使用BCA試劑盒用于蛋白濃度測(cè)定。 6. 當(dāng)室溫低于20度時(shí)緩沖液D中可能出現(xiàn)白色沉淀，使用前可將緩沖液D在37度水浴鍋加熱溶解沉淀。 操作方法： 1、 取20-30mg新鮮或冷凍組織樣品，放入試劑盒提供的1.5ml離心管中，加入250ul緩沖液A覆蓋組織，冰上孵育5分鐘。使用提供的研磨杵輕輕的扭轉(zhuǎn)研磨樣品1分鐘（40-60次）。研磨杵可以重復(fù)使用，用清水清潔后，用紙巾擦干即可。 2、 14000 X g，離心5分鐘。轉(zhuǎn)移200μl上清液(胞質(zhì)組分)到新的自備的離心管中保存。(如果上清液不夠澄清, 14000 X g，再離5分鐘進(jìn)一步澄清)。如上所述用研磨杵再次把沉淀進(jìn)一步研磨 (研磨60-100次)。研磨杵放置于管中，加入0.8 ml緩沖液A到管中。再研磨幾次，拿出研磨杵。用1毫升吸頭上下吹打15-20次混勻。在冰上孵育5-8分鐘，讓大的組織碎片通過重力作用沉到底部，將0.7 ml的上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的試劑盒提供的1.5 ml管中(盡量避免管底大的組織碎片)。 3、 500xg，離心2 min，棄去上清液。加入0.5 ml的緩沖液B，渦旋振蕩10-20秒重懸沉淀。冰上孵育5分鐘，2000 X g離心2分鐘，完全去除上清液。 4、 沉淀是分離的細(xì)胞核，根據(jù)不同的下游應(yīng)用有兩種核蛋白提取方式可選： A .變性核蛋白提取（提取出的核蛋白適用于SDS-PAGE、Western blotting等應(yīng)用） 用50μl緩沖液D重懸沉淀(懸液可能粘稠，這是正常的)。稱取50-60毫克的蛋白提取粉，加入沉淀(盡量避免接觸管壁)。用研磨杵扭轉(zhuǎn)研磨約60-100次。研磨杵仍置于離心管中，加入50 -150ul的緩沖液A到管中，再研磨幾次(使用緩沖液A的多少取決于沉淀的大小。研磨杵可以重復(fù)使用，用清水清潔后，用紙巾擦干即可)。14000 X g，離心5分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的自備離心管中(即是細(xì)胞核蛋白)�？蓪⒌鞍酌敢种苿┨砑拥胶说鞍兹芤褐胁�(chǔ)存于-20或-80度。蛋白質(zhì)濃度一般為1-2mg/ml。 B .非變性核蛋白提�。ㄌ崛〕龅暮说鞍走m用于ELISA、IP、酶活性測(cè)定、凝膠緩凝等應(yīng)用） 用50μl緩沖液N重懸沉淀。室溫孵育5分鐘。稱取50-60毫克蛋白提取粉加入沉淀(盡量避免接觸管壁)。用研磨杵扭轉(zhuǎn)研磨約60-100次。研磨杵仍置于離心管中，加入50 -150ul的緩沖液A到管中，再研磨幾次(使用緩沖液A的多少取決于沉淀的大小)。10000 X g，離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的自備離心管中(即是細(xì)胞核蛋白)�？蓪⒌鞍酌敢种苿┨砑拥胶说鞍兹芤褐胁�(chǔ)存于-20或-80度。蛋白質(zhì)濃度一般為0.5-1mg/ml。 關(guān)于胞質(zhì)和胞核內(nèi)參 許多抗體在WB中被用于檢查組分分離的交叉污染。文獻(xiàn)中常用的胞質(zhì)內(nèi)參包括但不限于GAPDH，HSP90，LC3 A/B，tublin，HIF1，ESR1，ACTB和Actin等。我們推薦使用GAPDH，HSP90或LC3 A/B,不推薦β-actin，因?yàn)锳ctin也存在于細(xì)胞核(見參考文獻(xiàn)3和4)。核內(nèi)參我們推薦LaminB1，LaminA/C，SC-35或histones。 參考文獻(xiàn) 1. Kuster et al (2011) Nuclear protein extraction from frozen porcine myocardium. JPhysiol. Biochem. 67:165-173. 2. Murray et al (2009) Assessment of ProteoExtract subcellular fractionation kit reveals limited and incomplete enrichment of nuclear subproteome from frozen liver and heart tissue. Proteomics. 9(15):3934-3938. 3. Dopie et al (2012) Active maintenance of nuclear actin by importin 9 supportstranscription. PNAS E544-E552. 4. Falahzadeh et al (2015) The potential roles of actin in nucleus. Cell J. 17:7-14. |
3樓2019-09-11 14:50:27
格桑梅朵lwy
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2樓2019-08-25 08:51:57
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