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格桑梅朵lwy新蟲 (小有名氣)
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[求助]
做NF-KB通路，細胞核、細胞質(zhì)中蛋白提取 不太懂啊，求助大神��！ 已有1人參與
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我想做動物組織的NF-kB通路，請問這個也可以既做細胞質(zhì)又做細胞核中的蛋白WB嗎？查文獻發(fā)現(xiàn)大家細胞這樣做的比較多一些，不知道動物組織是否也可以這么做？ NF-kB需要從胞漿中轉(zhuǎn)到細胞核中，才能引發(fā)轉(zhuǎn)錄，生成某些因子 |
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格桑梅朵lwy
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2樓2019-08-25 08:51:57
wanghm200810
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【答案】應(yīng)助回帖
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動物組織的也可以，算體內(nèi)實驗，細胞的算體外實驗。上升一個層級。組織胞質(zhì)胞核分離你可以看看這個 MinuteTM新鮮/冷凍組織胞質(zhì)胞核分離試劑盒 目錄號：NT-032 描述： 從細胞和組織中分離細胞質(zhì)和細胞核組分是一種常見的實驗。細胞樣品的組分分離相對簡單直接，然而，從組織樣品中特別是冷凍組織中將胞質(zhì)和胞核組分分離干凈是很具挑戰(zhàn)的。因為冷凍和反復(fù)凍融會引起組織細胞結(jié)構(gòu)的改變，加之不適當(dāng)?shù)膭驖{方式和效率低的提取緩沖液，使得交叉污染十分嚴(yán)重。目前大多數(shù)商業(yè)試劑盒設(shè)計可同時用于細胞和組織樣品，但是忽略了兩種類型樣品之間的結(jié)構(gòu)差異。因此，從新鮮/冷凍組織中分離胞質(zhì)和胞核組分時，交叉污染問題無法避免(見下文參考文獻1和2)。這款新型的胞質(zhì)和胞核分離試劑盒專用于組織樣品的胞質(zhì)胞核分離，試劑盒特有的緩沖液體系和獨特的操作方法可以將交叉污染降到最低。整個操作可以在30分鐘內(nèi)完成。 應(yīng)用： 可應(yīng)用于SDS-PAGE，immunoblottings，ELISA，IP，蛋白定位，凝膠遷移分析，2-D等其他應(yīng)用。 試劑盒組分 1.緩沖液A 25ml 2.緩沖液B 10ml 3.緩沖液D 1.5ml 4.緩沖液N 1.5ml 5.1.5ml離心管 40個 6.1.5ml研磨杵 2個 7.蛋白質(zhì)提取粉 2克 運輸：常溫運輸 儲存：常溫保存 重要產(chǎn)品信息 1. 實驗開始前將緩沖液A和緩沖液B冰上預(yù)冷。 2. 所有的離心步驟請使用4度或冷凍離心機。 3. 使用前推薦將蛋白酶抑制劑加入分裝的緩沖液A中。 4. 研究蛋白磷酸化，磷酸酶抑制劑應(yīng)在使用前加入分裝的緩沖液A和緩沖液B中。 5. 推薦使用BCA試劑盒用于蛋白濃度測定。 6. 當(dāng)室溫低于20度時緩沖液D中可能出現(xiàn)白色沉淀，使用前可將緩沖液D在37度水浴鍋加熱溶解沉淀。 操作方法： 1、 取20-30mg新鮮或冷凍組織樣品，放入試劑盒提供的1.5ml離心管中，加入250ul緩沖液A覆蓋組織，冰上孵育5分鐘。使用提供的研磨杵輕輕的扭轉(zhuǎn)研磨樣品1分鐘（40-60次）。研磨杵可以重復(fù)使用，用清水清潔后，用紙巾擦干即可。 2、 14000 X g，離心5分鐘。轉(zhuǎn)移200μl上清液(胞質(zhì)組分)到新的自備的離心管中保存。(如果上清液不夠澄清, 14000 X g，再離5分鐘進一步澄清)。如上所述用研磨杵再次把沉淀進一步研磨 (研磨60-100次)。研磨杵放置于管中，加入0.8 ml緩沖液A到管中。再研磨幾次，拿出研磨杵。用1毫升吸頭上下吹打15-20次混勻。在冰上孵育5-8分鐘，讓大的組織碎片通過重力作用沉到底部，將0.7 ml的上清液轉(zhuǎn)移到一個新的試劑盒提供的1.5 ml管中(盡量避免管底大的組織碎片)。 3、 500xg，離心2 min，棄去上清液。加入0.5 ml的緩沖液B，渦旋振蕩10-20秒重懸沉淀。冰上孵育5分鐘，2000 X g離心2分鐘，完全去除上清液。 4、 沉淀是分離的細胞核，根據(jù)不同的下游應(yīng)用有兩種核蛋白提取方式可選： A .變性核蛋白提�。ㄌ崛〕龅暮说鞍走m用于SDS-PAGE、Western blotting等應(yīng)用） 用50μl緩沖液D重懸沉淀(懸液可能粘稠，這是正常的)。稱取50-60毫克的蛋白提取粉，加入沉淀(盡量避免接觸管壁)。用研磨杵扭轉(zhuǎn)研磨約60-100次。研磨杵仍置于離心管中，加入50 -150ul的緩沖液A到管中，再研磨幾次(使用緩沖液A的多少取決于沉淀的大小。研磨杵可以重復(fù)使用，用清水清潔后，用紙巾擦干即可)。14000 X g，離心5分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的自備離心管中(即是細胞核蛋白)�？蓪⒌鞍酌敢种苿┨砑拥胶说鞍兹芤褐胁Υ嬗�-20或-80度。蛋白質(zhì)濃度一般為1-2mg/ml。 B .非變性核蛋白提�。ㄌ崛〕龅暮说鞍走m用于ELISA、IP、酶活性測定、凝膠緩凝等應(yīng)用） 用50μl緩沖液N重懸沉淀。室溫孵育5分鐘。稱取50-60毫克蛋白提取粉加入沉淀(盡量避免接觸管壁)。用研磨杵扭轉(zhuǎn)研磨約60-100次。研磨杵仍置于離心管中，加入50 -150ul的緩沖液A到管中，再研磨幾次(使用緩沖液A的多少取決于沉淀的大小)。10000 X g，離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的自備離心管中(即是細胞核蛋白)�？蓪⒌鞍酌敢种苿┨砑拥胶说鞍兹芤褐胁Υ嬗�-20或-80度。蛋白質(zhì)濃度一般為0.5-1mg/ml。 關(guān)于胞質(zhì)和胞核內(nèi)參 許多抗體在WB中被用于檢查組分分離的交叉污染。文獻中常用的胞質(zhì)內(nèi)參包括但不限于GAPDH，HSP90，LC3 A/B，tublin，HIF1，ESR1，ACTB和Actin等。我們推薦使用GAPDH，HSP90或LC3 A/B,不推薦β-actin，因為Actin也存在于細胞核(見參考文獻3和4)。核內(nèi)參我們推薦LaminB1，LaminA/C，SC-35或histones。 參考文獻 1. Kuster et al (2011) Nuclear protein extraction from frozen porcine myocardium. JPhysiol. Biochem. 67:165-173. 2. Murray et al (2009) Assessment of ProteoExtract subcellular fractionation kit reveals limited and incomplete enrichment of nuclear subproteome from frozen liver and heart tissue. Proteomics. 9(15):3934-3938. 3. Dopie et al (2012) Active maintenance of nuclear actin by importin 9 supportstranscription. PNAS E544-E552. 4. Falahzadeh et al (2015) The potential roles of actin in nucleus. Cell J. 17:7-14. |
3樓2019-09-11 14:50:27
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