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swatow_yu新蟲 (初入文壇)
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[求助]
關于qPCR絕對定量質粒標曲模板加量的問題 已有2人參與
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各位師兄師姐，有個關于qPCR絕對定量的問題想請教。 這是一個用絕對定量方法，構建質粒，求得標曲，代入待測樣本Ct值求拷貝量的實驗 的菜鳥實驗。 然后本菜狗被一個問題繞暈了。希望大佬們解答。 1，質粒nanodrop測得濃度，公式 （6.02×10^9×濃度×10^-9）/（質粒bp+連接片段bp）×660 =拷貝數(shù)（copies/μL）。 將上面質粒濃度稀釋到10^9copies/μL，因為單位是copies/μL，就開始有點繞不明白 2，體系20μL如下： permix（10μL）、 F引物（0.8μL）、 R引物（0.8μL）、 ROX校正熒光（0.4μL）、 水（6μL）、 待測模板/標曲質粒（2μL）。 3，問題是： 整個標曲體系中加了 2μL 的 10^9（copies/μL） ~10^1（copies/μL）的標曲質粒DNA，那么此刻體系含有的拷貝量就是 2μL x 10^9 copies，那么這一個梯度的標曲體系，它的拷貝量是算作 10^9 還是 2x10^9 ？？？。。 在畫標曲的時候，這一個梯度的坐標應該是 x2μL 還是不 x2μL ，不 x2 的話待測模板的濃度是不是也不 x2μL。 4，因為看了別人的實驗記錄，是體系加2μL的標曲質粒DNA或者待測模板，但是標曲的拷貝數(shù)坐標并沒有 x2， |
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4樓2019-12-27 17:38:15
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