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三只0小豬仔新蟲 (初入文壇)
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[求助]
目的基因連接T載體 菌落pcr沒有目的條帶 已有3人參與
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我PCR產(chǎn)物連接T載體，做藍(lán)白斑篩選，都是白斑，挑但菌落，做菌落pcr，沒有目的條帶，難道都是假陽性嗎？我菌落pcr引物跟目的基因一樣 求指教 @飛約瘋?cè)嗽?/u> 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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你的pcr引物跟目的基因一樣是無法從pcr來斷定是否為假陽性的，推薦用載體上的插入位點(diǎn)前后一段200-300bp的基因做引物，這樣可以判斷是否為假陽性。然后藍(lán)白斑篩選其實(shí)有一些感受態(tài)有表達(dá)缺陷，比如說jm110,在加了顯色劑的平板上也不顯色的。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2019-06-02 18:33:35
2樓2019-06-02 15:51:44
三只0小豬仔
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4樓2019-06-03 07:31:58
xinxiyuzhou
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5樓2019-06-03 08:02:05
6樓2019-06-03 08:38:40
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如果在你的感受態(tài)下空載體確定會(huì)顯藍(lán)斑而且沒有涂錯(cuò)板子的話，建議先在基因插入位點(diǎn)前后100bp左右找兩條引物合一下，畢竟這個(gè)載體以后可能還會(huì)再用的嘛。這個(gè)基因引物如果也沒有條帶就可以盲送試一下，如果擴(kuò)出來是空載大小就要重做，建議首尾加重組臂做重組，效率會(huì)很高，平連效率還挺低的。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
7樓2019-06-03 08:45:41
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送紅花一朵 |
我是用的TA克隆，cDNA作為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因，回收純化之后連接的T載體，PCR產(chǎn)物是帶A尾的，做了陽性對照。是T載體購買時(shí)自帶的，按操作連接之后轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，菌落PCR的引物與目的基因一樣，實(shí)驗(yàn)室之前也是直接用的一樣的引物 ，不知道哪里出了問題，還麻煩您指教一下  發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
8樓2019-06-03 11:23:40
A913162220
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9樓2019-06-03 16:28:52
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10樓2019-06-03 20:06:52
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