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手把手教你做免疫組織化學(xué)IHC實驗
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看到很多人發(fā)的帖子，我也想把我掌握的免疫組化方法與大家分享，不一定能做到面面俱到，但是融合了步驟和一些原理性東西給大家當(dāng)基礎(chǔ)知識儲備。要是覺得這不錯，你就點贊或者收藏。 一、脫蠟水化： 切片在脫蠟前，放在APES（防止脫片用的，缺點是有低毒性） 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干或60°C恒溫箱中烘烤20分鐘，然后將組織切片置于二甲苯中浸泡10min，更換二甲苯再浸泡10min，無水乙醇浸泡 10min，更換無水乙醇再浸泡10min，然后依次95%乙醇，70%乙醇，50%的乙醇各5min，最后用蒸餾水浸泡 5min； 原理： ①二甲苯的作用：溶解蠟塊，起到脫蠟的作用； ②梯度酒精是為了除去對人體有害的二甲苯，但高濃度的酒精時間過長會導(dǎo)致組織細(xì)胞變形，影響抗原的表達(dá)，也會影響到組織在顯微鏡下的光學(xué)形態(tài)，所以用梯度酒精； ③保持玻片在自來水中，直到準(zhǔn)備進行抗原修復(fù)。任何時候都不應(yīng)該使玻片干燥，干燥會導(dǎo)致非特異性抗體結(jié)合，從而出現(xiàn)高背景染色； 技巧： ①觀察是否脫蠟完全，因為石蠟是不溶于水的，如果石蠟脫不完全，水流上去會模糊還有滯流感。原則就是徹底、干凈、完全的脫去石蠟。 二、 清洗：先用用蒸餾水溫柔的沖洗一會，更換PBS沖洗5min，再用PBS沖洗5min； 注意：沖洗時盡量溫柔，可以多沖洗一會； ①可以將玻片放在臥式缸里，在搖床上輕輕晃3-5min,重復(fù)2-3次 三、抗原修復(fù)：（此步驟根據(jù)試驗需要可增減） 將切片放入盛有0.01M枸櫞酸緩沖液（PH 6.0）中置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續(xù) 10~15分鐘取出容器，室溫冷卻30分鐘； 注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型； 原理： ①枸櫞酸緩沖液，是抗原修復(fù)液的一種，一部分抗體使用這種修復(fù)液修復(fù)的效果最好。 ②對于石蠟切片的免疫組化實驗時，必須經(jīng)過抗原修復(fù)，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加抗原檢測率。修復(fù)的方法有很多種，我采用的是熱修復(fù)。對于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應(yīng)不一樣，可進行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。 ③修復(fù)方法從強到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種我們這次實驗用的枸櫞酸緩沖液，此外還有EDTA緩沖液。（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH的等）。 四、消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性 用3%H2O2滴加到切片上，封閉5-10min去除內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗2-5min，沖洗三次。 特別說明：在一些過氧化物豐富的組織里面（肝臟、胎盤、血管瘤、急性炎癥組織等）3%H2O2 也不能完全消除內(nèi)源性的過氧化物，改進的方法就是先用3%H2O2阻斷10min,再用0.5%的高碘酸溶液阻斷10min。 五、封閉：用和二抗來源一致的血清在保濕盒中于37℃孵育15-30min，然后甩去封閉用血清，勿洗； 注意：封閉時間根據(jù)具體實驗調(diào)整；封閉液一般選用5%BSA或與二抗來源一致的血清，切記是BSA，不是PBS.很多論壇寫的是PBS,太坑了。 ①使用血清好還是BSA好？ 答：第一是待檢樣本會非特異性的和蛋白結(jié)合，從而導(dǎo)致背景過高，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分非特異性的結(jié)合，從這點看，BSA和血清沒有明顯區(qū)別。 第二是待檢樣本中可能會有Fc受體，可以和抗體恒定區(qū)結(jié)合，與抗體特異性無關(guān)，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間結(jié)合。BSA則無法封閉Fc受體。 六、 一抗孵育： 滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，將切片放在保濕盒中于4℃冰箱中過夜孵育或者溫箱37℃孵育1-2個小時。 小技巧：一抗孵育可以是4℃冰箱中過夜孵育，也可以選擇37℃孵育1-2小時。關(guān)鍵就是溫度要控制恒定。普遍情況下都選擇4℃冰箱中過夜孵育，因為它的溫度穩(wěn)比室溫要穩(wěn)定。 注意：適當(dāng)比例稀釋是可以查到的，很多說明書或該公司網(wǎng)站產(chǎn)品詳情頁都有，實在不行你直接打電話去問公司的技術(shù)支持，他們給的建議更適合他們的產(chǎn)品，可別想當(dāng)然。 七、清洗：過夜后的切片用PBS沖洗2，沖洗3次； 注意：一定要單獨沖洗，多個片子防止交叉反應(yīng)造成污染；溫柔沖洗，防止切片的脫落 八、二抗孵育： 滴加生物素標(biāo)記的二抗在保濕盒中于37℃孵育30分鐘。加之前吹干凈標(biāo)本上的水（可以用吸水紙沿著材料周圍畫圈把水吸干） 注意：其實抗體孵育過程都是一致的目的都是結(jié)合，所以一定要保證在一個環(huán)境穩(wěn)定和穩(wěn)定恒定的條件下進行，你也許會在實驗室發(fā)現(xiàn)一個大紙條寫著實驗中，勿動！ 九、清洗：切片用PBS沖洗2min，沖洗3次； 十、滴加適當(dāng)比例稀釋的HRP標(biāo)記的親和素，再37℃孵育20min 十一、清洗：用PBS沖洗2min，沖洗3次 十二、顯色：加入顯色劑顯色，選擇DAB（快速滴入，觀察染**況）根據(jù)顯微鏡下的觀察決定終止顯色的時間一般都在3-10min左右，最常用5min。 十三、自來水沖洗：自來水充分沖洗10-15min, 注意：沖洗的時候要注意水流不要太大，緩慢的沖洗。 十四、復(fù)染：加一大滴蘇木精復(fù)染，細(xì)胞核蛋白幾秒就可以，細(xì)胞漿或者細(xì)胞膜蛋白需要然20-30S，自來水沖洗，再用PBS返藍(lán)5min。 注意： ①復(fù)染的時間是需要摸索的，這個與蘇木精的配制時間有關(guān)。如果是第一次做，可以請教一下實驗室的老師問一下經(jīng)驗，自己在多備兩個片子，摸索感受一下。 ②若試驗?zāi)康闹皇窍胝f明組織中蛋白表達(dá)的有無、量的多少和顏色的深淺，那就不需要蘇木素復(fù)染；若實驗?zāi)康氖窍肟唇M織切片蛋白定位在胞核還是胞漿，那就最好蘇木素復(fù)染； ③復(fù)染試劑的選擇與顯色系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)？如果是AEC和DAB系統(tǒng)，那么顯色應(yīng)該是紅色和棕黃色，這樣你用蘇木素復(fù)染核就不會影響陽性細(xì)胞的觀察，更何況你所檢測的抗原位于胞漿中呢。如果你用BCIP/NBT系統(tǒng)顯色，則顯色為紫黑色，此時你復(fù)染核就不能用蘇木素了，因兩者的色澤相似。你可以選用甲基綠溶液復(fù)染核，這樣核為鮮艷的蘭綠色，不容易與BCIP/NBT系統(tǒng)相混淆了。 ④關(guān)于返藍(lán)的選擇，我估計大家看到很多不同選擇（有水、氨水、PBS、飽和碳酸鋰等等）。本質(zhì)來說，返藍(lán)的原理是蘇木素遇堿變藍(lán)色，所以以上這幾種都是偏弱堿性的物質(zhì)。 十五、脫水透明 依次用50%， 70%， 95%酒精各5min浸泡切片，最后用100%酒精浸泡10min，更換酒精浸泡10min，最后用二甲苯浸泡10分鐘，更換二甲苯，再浸泡10min； 注意：梯度酒精的作用：脫水，以便片子長期保存；二甲苯是為了使片子更加透明； 十六、封片 撈出，用樹脂封片，一滴/張,在其上蓋上小玻片 封好的組織切片，放入超凈臺中，打開抽風(fēng)，沖一段時間，最后把切片放在窗臺上涼2-3天，就可收起來。 注意：封片用的材料與顯色系統(tǒng)相關(guān)：DAB顯色的石蠟切片免疫組化封片用中性樹脂或者中性快干膠都可以啊，AEC顯色的用水溶性的封片劑就可以，免疫熒光的話需要專門的防脆變的封片劑或者用甘油也行（但是保存時間很短）。 免疫組化是一個經(jīng)驗養(yǎng)成型實驗，實驗時最好有個貼心的師弟師妹當(dāng)助手，做實驗之前把該用到的東西都悉心準(zhǔn)備一下，在腦海中熟悉一下流程。每一個步驟的材料選擇都有很多依據(jù)，這需要我們經(jīng)�？纯创蠹曳窒淼慕�(jīng)驗帖增加基礎(chǔ)知識儲備，這個對于實驗室大牛得養(yǎng)成有很大的幫助，祝您大功告成！附件含【免疫組化原理及實例分析資源包】 |
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2019-05-27 15:07:01, 60.37 K
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