 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 3408 | 回復: 0 | ||
[資源]
手把手教你做免疫組織化學IHC實驗
|
|
看到很多人發(fā)的帖子，我也想把我掌握的免疫組化方法與大家分享，不一定能做到面面俱到，但是融合了步驟和一些原理性東西給大家當基礎知識儲備。要是覺得這不錯，你就點贊或者收藏。 一、脫蠟水化： 切片在脫蠟前，放在APES（防止脫片用的，缺點是有低毒性） 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干或60°C恒溫箱中烘烤20分鐘，然后將組織切片置于二甲苯中浸泡10min，更換二甲苯再浸泡10min，無水乙醇浸泡 10min，更換無水乙醇再浸泡10min，然后依次95%乙醇，70%乙醇，50%的乙醇各5min，最后用蒸餾水浸泡 5min； 原理： ①二甲苯的作用：溶解蠟塊，起到脫蠟的作用； ②梯度酒精是為了除去對人體有害的二甲苯，但高濃度的酒精時間過長會導致組織細胞變形，影響抗原的表達，也會影響到組織在顯微鏡下的光學形態(tài)，所以用梯度酒精； ③保持玻片在自來水中，直到準備進行抗原修復。任何時候都不應該使玻片干燥，干燥會導致非特異性抗體結合，從而出現(xiàn)高背景染色； 技巧： ①觀察是否脫蠟完全，因為石蠟是不溶于水的，如果石蠟脫不完全，水流上去會模糊還有滯流感。原則就是徹底、干凈、完全的脫去石蠟。 二、 清洗：先用用蒸餾水溫柔的沖洗一會，更換PBS沖洗5min，再用PBS沖洗5min； 注意：沖洗時盡量溫柔，可以多沖洗一會； ①可以將玻片放在臥式缸里，在搖床上輕輕晃3-5min,重復2-3次 三、抗原修復：（此步驟根據(jù)試驗需要可增減） 將切片放入盛有0.01M枸櫞酸緩沖液（PH 6.0）中置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續(xù) 10~15分鐘取出容器，室溫冷卻30分鐘； 注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型； 原理： ①枸櫞酸緩沖液，是抗原修復液的一種，一部分抗體使用這種修復液修復的效果最好。 ②對于石蠟切片的免疫組化實驗時，必須經過抗原修復，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加抗原檢測率。修復的方法有很多種，我采用的是熱修復。對于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應不一樣，可進行熱修復、胰酶消化、既不修復也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。 ③修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。修復液也分為若干種我們這次實驗用的枸櫞酸緩沖液，此外還有EDTA緩沖液。（具體的可以查閱相關資料，大量的：中性的、高pH的等）。 四、消除內源性過氧化物酶的活性 用3%H2O2滴加到切片上，封閉5-10min去除內源性過氧化物酶。PBS沖洗2-5min，沖洗三次。 特別說明：在一些過氧化物豐富的組織里面（肝臟、胎盤、血管瘤、急性炎癥組織等）3%H2O2 也不能完全消除內源性的過氧化物，改進的方法就是先用3%H2O2阻斷10min,再用0.5%的高碘酸溶液阻斷10min。 五、封閉：用和二抗來源一致的血清在保濕盒中于37℃孵育15-30min，然后甩去封閉用血清，勿洗； 注意：封閉時間根據(jù)具體實驗調整；封閉液一般選用5%BSA或與二抗來源一致的血清，切記是BSA，不是PBS.很多論壇寫的是PBS,太坑了。 ①使用血清好還是BSA好？ 答：第一是待檢樣本會非特異性的和蛋白結合，從而導致背景過高，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分非特異性的結合，從這點看，BSA和血清沒有明顯區(qū)別。 第二是待檢樣本中可能會有Fc受體，可以和抗體恒定區(qū)結合，與抗體特異性無關，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間結合。BSA則無法封閉Fc受體。 六、 一抗孵育： 滴加適當比例稀釋的一抗，將切片放在保濕盒中于4℃冰箱中過夜孵育或者溫箱37℃孵育1-2個小時。 小技巧：一抗孵育可以是4℃冰箱中過夜孵育，也可以選擇37℃孵育1-2小時。關鍵就是溫度要控制恒定。普遍情況下都選擇4℃冰箱中過夜孵育，因為它的溫度穩(wěn)比室溫要穩(wěn)定。 注意：適當比例稀釋是可以查到的，很多說明書或該公司網(wǎng)站產品詳情頁都有，實在不行你直接打電話去問公司的技術支持，他們給的建議更適合他們的產品，可別想當然。 七、清洗：過夜后的切片用PBS沖洗2，沖洗3次； 注意：一定要單獨沖洗，多個片子防止交叉反應造成污染；溫柔沖洗，防止切片的脫落 八、二抗孵育： 滴加生物素標記的二抗在保濕盒中于37℃孵育30分鐘。加之前吹干凈標本上的水（可以用吸水紙沿著材料周圍畫圈把水吸干） 注意：其實抗體孵育過程都是一致的目的都是結合，所以一定要保證在一個環(huán)境穩(wěn)定和穩(wěn)定恒定的條件下進行，你也許會在實驗室發(fā)現(xiàn)一個大紙條寫著實驗中，勿動！ 九、清洗：切片用PBS沖洗2min，沖洗3次； 十、滴加適當比例稀釋的HRP標記的親和素，再37℃孵育20min 十一、清洗：用PBS沖洗2min，沖洗3次 十二、顯色：加入顯色劑顯色，選擇DAB（快速滴入，觀察染**況）根據(jù)顯微鏡下的觀察決定終止顯色的時間一般都在3-10min左右，最常用5min。 十三、自來水沖洗：自來水充分沖洗10-15min, 注意：沖洗的時候要注意水流不要太大，緩慢的沖洗。 十四、復染：加一大滴蘇木精復染，細胞核蛋白幾秒就可以，細胞漿或者細胞膜蛋白需要然20-30S，自來水沖洗，再用PBS返藍5min。 注意： ①復染的時間是需要摸索的，這個與蘇木精的配制時間有關。如果是第一次做，可以請教一下實驗室的老師問一下經驗，自己在多備兩個片子，摸索感受一下。 ②若試驗目的只是想說明組織中蛋白表達的有無、量的多少和顏色的深淺，那就不需要蘇木素復染；若實驗目的是想看組織切片蛋白定位在胞核還是胞漿，那就最好蘇木素復染； ③復染試劑的選擇與顯色系統(tǒng)相關聯(lián)？如果是AEC和DAB系統(tǒng)，那么顯色應該是紅色和棕黃色，這樣你用蘇木素復染核就不會影響陽性細胞的觀察，更何況你所檢測的抗原位于胞漿中呢。如果你用BCIP/NBT系統(tǒng)顯色，則顯色為紫黑色，此時你復染核就不能用蘇木素了，因兩者的色澤相似。你可以選用甲基綠溶液復染核，這樣核為鮮艷的蘭綠色，不容易與BCIP/NBT系統(tǒng)相混淆了。 ④關于返藍的選擇，我估計大家看到很多不同選擇（有水、氨水、PBS、飽和碳酸鋰等等）。本質來說，返藍的原理是蘇木素遇堿變藍色，所以以上這幾種都是偏弱堿性的物質。 十五、脫水透明 依次用50%， 70%， 95%酒精各5min浸泡切片，最后用100%酒精浸泡10min，更換酒精浸泡10min，最后用二甲苯浸泡10分鐘，更換二甲苯，再浸泡10min； 注意：梯度酒精的作用：脫水，以便片子長期保存；二甲苯是為了使片子更加透明； 十六、封片 撈出，用樹脂封片，一滴/張,在其上蓋上小玻片 封好的組織切片，放入超凈臺中，打開抽風，沖一段時間，最后把切片放在窗臺上涼2-3天，就可收起來。 注意：封片用的材料與顯色系統(tǒng)相關：DAB顯色的石蠟切片免疫組化封片用中性樹脂或者中性快干膠都可以啊，AEC顯色的用水溶性的封片劑就可以，免疫熒光的話需要專門的防脆變的封片劑或者用甘油也行（但是保存時間很短）。 免疫組化是一個經驗養(yǎng)成型實驗，實驗時最好有個貼心的師弟師妹當助手，做實驗之前把該用到的東西都悉心準備一下，在腦海中熟悉一下流程。每一個步驟的材料選擇都有很多依據(jù)，這需要我們經�？纯创蠹曳窒淼慕涷炋黾踊A知識儲備，這個對于實驗室大牛得養(yǎng)成有很大的幫助，祝您大功告成！附件含【免疫組化原理及實例分析資源包】 |
回復此樓» 本帖附件資源列表
-
歡迎監(jiān)督和反饋：小木蟲僅提供交流平臺，不對該內容負責。
本內容由用戶自主發(fā)布，如果其內容涉及到知識產權問題，其責任在于用戶本人，如對版權有異議，請聯(lián)系郵箱：xiaomuchong@tal.com - 附件 1 : 免疫組化原理及實例分析資源包.docx
2019-05-27 15:07:01, 60.37 K
» 猜你喜歡
085600 材料與化工 298
已經有8人回復
-
266求調劑
已經有5人回復
-
0854總分272
已經有6人回復
-
EST拒稿重投
已經有3人回復
-
歡迎采礦、地質、巖土、計算機、人工智能等專業(yè)的同學報考
已經有11人回復
-
0703化學學碩 288分
已經有4人回復
-
接收調劑
已經有23人回復
-
化學 0703求調劑 總分293 一志愿211
已經有3人回復
-
304分材料專碩求調劑
已經有5人回復
-
0703化學 學碩 理工科均可 不區(qū)分研究方向 總分279求調劑
已經有5人回復
» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關版塊跳轉
我要訂閱樓主 weiyong2 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[基金申請]
 成果系統(tǒng)訪問量大，請15分鐘后再嘗試。由此給您造成的不便，敬請諒解。
+9
|
xhuama 2026-03-02 | 10/500 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 0703化學306調劑 +4 | 26要上岸 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
[考研] 283求調劑 +9 | 鹿沫笙 2026-03-02 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 267求調劑 +6 | 釣魚佬as 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 291求調劑 +3 | MuoLuo1312 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[論文投稿]
通訊作者寫誰，問題是你意想不到的問題
 15+3
|
阿爾法啊 2026-03-01 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 考研復試調劑，過國家線的同學都可報名 +7 | 黑！在干嘛 2026-02-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 338求調劑 +5 | 18162027187 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 288求調劑 +3 | 少71.8 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0854復試調劑 276 +5 | wmm9 2026-03-01 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0856材料求調劑 +12 | hyf hyf hyf 2026-02-28 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 材料復試調劑 +5 | 學材料的點 2026-03-01 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 303求調劑 +5 | 今夏不夏 2026-03-01 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 265分求調劑不調專業(yè)和學校有行學上就 +6 | 禮堂丁真258 2026-02-28 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 322求調劑 +3 | 熊境喆 2026-03-01 | 3/150 |
|
|
|
[基金申請] 成果系統(tǒng)訪問量大，請一小時后再嘗試。---NSFC啥時候好哦，已經兩天這樣了 +4 | NSFC2026我來了 2026-02-28 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 272求調劑 +6 | 田智友 2026-02-28 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 313求調劑 +3 | 水流年lc 2026-02-28 | 3/150 |
|
|
|
[考研]
尋找調劑
+4
|
LYidhsjabdj 2026-02-28 | 4/200 |
|
|
|
[論文投稿]
求助coordination chemistry reviews 的寫作模板
10+3
|
ljplijiapeng 2026-02-27 | 4/200 |
|