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[資源]
Western blotting之樣品制備
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無論你是處理細(xì)胞還是組織樣本，蛋白提取都是一個(gè)很艱難的過程。要么使用物理方法將細(xì)胞破碎或者使用化學(xué)試劑處理細(xì)胞進(jìn)行裂解。如果第一步提取就搞砸的話，那么長時(shí)間小心翼翼培養(yǎng)的細(xì)胞就會(huì)完全浪費(fèi)。這里有一些建議可以幫助你進(jìn)行樣品的抽提。 頭號(hào)公敵：蛋白酶 無論您選擇哪種提取方法，蛋白酶都將是一個(gè)主要的關(guān)注點(diǎn)。當(dāng)你需要的時(shí)候，蛋白酶是很有用的，但是如果你不需要，它們會(huì)在短時(shí)間內(nèi)降解目標(biāo)蛋白。在細(xì)胞被胰蛋白酶消化后，在裂解前徹底清洗去除所有的胰蛋白酶。同樣的道理也適用于組織，在溶解前要徹底清洗，以清除殘留的血液，其中也含有蛋白酶。清洗之后細(xì)胞是干凈的，準(zhǔn)備裂解，要添加蛋白酶抑制劑到裂解緩沖液中。使用蛋白酶抑制劑，并保持樣本在冰上，以防止蛋白降解。如果研究的是磷酸化蛋白，也可以添加磷酸酶抑制劑。 物理vs.化學(xué)方法破碎細(xì)胞 物理裂解方法包括超聲、均質(zhì)、反復(fù)凍融和機(jī)械破碎(研磨、切碎和碾壓)。當(dāng)不想把化學(xué)和酶引入到提取系統(tǒng)中，物理裂解是理想的。然而，專業(yè)設(shè)備的要求往往會(huì)使過程不一致，難以擴(kuò)大規(guī)模，成本過高。由于物理方法有關(guān)的壓力和溫度很高，因此還必須小心避免蛋白變性和聚集。在整個(gè)過程中，把所有的東西都預(yù)先冷卻，并保持樣品的低溫狀態(tài)。 如果您無法使用物理方法裂解細(xì)胞，請(qǐng)不要擔(dān)心。有很多抽提試劑可以幫助提取蛋白。試劑裂解法因其操作簡(jiǎn)便、蛋白提取量高、穩(wěn)定性好、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)而日益受到人們的歡迎。試劑裂解法的主要缺點(diǎn)是一些鹽和去垢劑等干擾下游分析。如果進(jìn)行蛋白功能研究，在選擇緩沖液和去垢劑時(shí)需要謹(jǐn)慎。 去垢劑的選擇 如果抽提的樣品量大，添加SDS和其他離子去垢劑到你的緩沖液將是你最好的選擇。對(duì)于Western blotting，使用含有SDS的緩沖液是理想的，例如1X RIPA，因?yàn)樗谌芙饧?xì)胞蛋白方面非常有效。如果蛋白需要在其天然構(gòu)象中正常發(fā)揮作用，最好使用溫和的提取方法，使用非離子去垢劑，如NP-40或Triton X-100。 濃度測(cè)定：最后，使用Bradford、BCA或Lowry進(jìn)行蛋白的測(cè)定，進(jìn)行蛋白的等量上樣。 |
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2019-05-07 10:57:14, 172.43 K
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申博
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4樓2019-12-06 11:55:47
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zz5312樓
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Mi_春春3樓
2019-09-19 08:33
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