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細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低的陷阱
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細(xì)胞轉(zhuǎn)染是細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的一種常用的技術(shù)手段。而轉(zhuǎn)染效率低下卻是實驗人員經(jīng)常遇到的問題，尤其是原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染難度更大�，F(xiàn)分享幾個細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗常見的幾個陷阱，望實驗人員能夠注意。 1.準(zhǔn)備不足 做細(xì)胞轉(zhuǎn)染的時候，在開展正式實驗前要多做預(yù)試驗，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括：轉(zhuǎn)染試劑的用量、DNA密度、細(xì)胞密度、試劑和DNA混合孵育時間等等。 2.細(xì)胞污染 細(xì)胞污染也是造成細(xì)胞死亡，轉(zhuǎn)染效率低下的一大原因。首先，轉(zhuǎn)染細(xì)胞用的質(zhì)粒必須保證無菌。而現(xiàn)在市場上的一般的質(zhì)粒提取試劑盒都做不到絕對無菌。分享一個小秘訣：將提完質(zhì)粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，這樣就除菌了。 3.質(zhì)粒質(zhì)量問題 轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒首先要保證數(shù)量，一般為2μg以上。質(zhì)粒純度不夠或者含有細(xì)菌LPS或其他對細(xì)胞有毒害作用的物質(zhì)，也會影響轉(zhuǎn)染效率。這個時候，就應(yīng)該對質(zhì)粒進(jìn)行純化和濃縮。 4.細(xì)胞狀態(tài)不好 細(xì)胞狀態(tài)不好，會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下。一般進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。如果是貼壁細(xì)胞的話，貼壁率應(yīng)該在70-80%；如果是懸浮細(xì)胞的話，應(yīng)該是6×105個/孔（24孔板），一般是轉(zhuǎn)染前一天換液，轉(zhuǎn)染前用無血清培養(yǎng)基或PBS洗細(xì)胞一次。 5.轉(zhuǎn)染試劑問題 脂質(zhì)體試劑毒性較大，易造成細(xì)胞死亡和轉(zhuǎn)染效率底下。可選擇非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，如Entranster試劑。 |
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