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細胞轉(zhuǎn)染效率低的陷阱
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細胞轉(zhuǎn)染是細胞生物學和分子生物學的一種常用的技術(shù)手段。而轉(zhuǎn)染效率低下卻是實驗人員經(jīng)常遇到的問題，尤其是原代細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染難度更大�，F(xiàn)分享幾個細胞轉(zhuǎn)染實驗常見的幾個陷阱，望實驗人員能夠注意。 1.準備不足 做細胞轉(zhuǎn)染的時候，在開展正式實驗前要多做預試驗，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括：轉(zhuǎn)染試劑的用量、DNA密度、細胞密度、試劑和DNA混合孵育時間等等。 2.細胞污染 細胞污染也是造成細胞死亡，轉(zhuǎn)染效率低下的一大原因。首先，轉(zhuǎn)染細胞用的質(zhì)粒必須保證無菌。而現(xiàn)在市場上的一般的質(zhì)粒提取試劑盒都做不到絕對無菌。分享一個小秘訣：將提完質(zhì)粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，這樣就除菌了。 3.質(zhì)粒質(zhì)量問題 轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒首先要保證數(shù)量，一般為2μg以上。質(zhì)粒純度不夠或者含有細菌LPS或其他對細胞有毒害作用的物質(zhì)，也會影響轉(zhuǎn)染效率。這個時候，就應該對質(zhì)粒進行純化和濃縮。 4.細胞狀態(tài)不好 細胞狀態(tài)不好，會導致轉(zhuǎn)染效率低下。一般進行轉(zhuǎn)染的細胞應該處于對數(shù)生長期。如果是貼壁細胞的話，貼壁率應該在70-80%；如果是懸浮細胞的話，應該是6×105個/孔（24孔板），一般是轉(zhuǎn)染前一天換液，轉(zhuǎn)染前用無血清培養(yǎng)基或PBS洗細胞一次。 5.轉(zhuǎn)染試劑問題 脂質(zhì)體試劑毒性較大，易造成細胞死亡和轉(zhuǎn)染效率底下。可選擇非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，如Entranster試劑。 |
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