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四葉草B-)新蟲 (初入文壇)
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[求助]
蛋白破碎，純化問題
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1. 200ml大腸桿菌離心棄上清后應(yīng)該加多少緩沖液重懸破碎 2. 破碎功率多少合適呢，之前都是450w，25-30min，破2秒停1秒。最后液體特別清澈，沉淀特別少，是不是破得太過了？ 3. 測破碎上清酶活很高，但是最近純化發(fā)現(xiàn)酶濃度太低，居然只有0.0幾mg/ml，我用AKATA純化的，進(jìn)樣量1ml，是不是上樣太少呢，最后酶活有，但是與粗酶液比差太多。 4. 之前是100ml菌液加10ml緩沖液重懸破碎，一代準(zhǔn)備200ml加10ml試試，看看粗酶液濃度高會不會使純化后濃度也高點(diǎn) 5. 重懸菌體用的Tris-HCL（PH8.0），純化結(jié)合液用的PBS（PH7.4含少量咪唑），兩個緩沖液不一致會有影響嗎？ 懇請大家?guī)兔χ更c(diǎn)一下！非常感謝！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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200ml大概10mlbuffer就夠了～純化后只有零點(diǎn)幾的濃度說明你的蛋白根本就沒有吧，是不是你的蛋白就不掛柱呢？看一下你的序列，rbs后面是否有6個His～超聲的話，我們一般超2s停5s，保證菌體溫度不會過高～ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
2樓2019-03-05 09:32:54
四葉草B-)
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 17.5
- 帖子: 47
- 在線: 5.5小時
- 蟲號: 9290770
- 注冊: 2018-07-02
- 專業(yè): 生物信息學(xué)
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可是有酶活，是不是說明有目的蛋白，只是掛上去的太少或者表達(dá)得就少？。親，重懸菌體用的緩沖液跟純化用的不一樣會影響純化結(jié)果不？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2019-03-05 10:12:56
4樓2019-03-05 11:46:59
5樓2019-03-05 11:49:07
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