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書(shū)畫(huà)江湖新蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
western-blot化學(xué)發(fā)光(ECL)的特異性差怎么辦?
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特異性差,出現(xiàn)雜帶或非特異條帶的原因可能有以下幾個(gè)方面: 1. 蛋白上樣量過(guò)大。可降低蛋白上樣量。 2. 一抗是多克隆抗體,或一抗、二抗?jié)舛忍摺?筛鼡Q成單克隆抗體,或降低抗體濃度,縮短抗體孵育時(shí)間,優(yōu)化一抗和二抗的使用濃度。 3. 洗膜不充分?稍黾酉茨ご螖(shù)和Buffer用量,延長(zhǎng)洗膜時(shí)間,或在Wash Buffer中添加終濃度0.05%的Tween-20。 4. 目的蛋白在體內(nèi)存在多種修飾形式,如乙;,甲基化,磷酸化,糖基化等?刹殚單墨I(xiàn),用合適的方法去除蛋白的修飾,或選擇合適的抗體。 5. 目的蛋白降解。重新準(zhǔn)備蛋白樣品,并加入足夠的蛋白酶抑制劑。 6. 發(fā)光液質(zhì)量問(wèn)題,可選用發(fā)光清晰的ECL發(fā)光液,如Enlight。 |
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