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qPCR過表達(dá)成功為何western跑不出flag？ 已有1人參與
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已有表達(dá)某白血病融合基因A的測序成功的質(zhì)粒（MSCV-A-flag-IRES-GFP），包病毒后感染正常小鼠骨髓細(xì)胞系，感染后48hGFP陽性率不高在15%左右，分選GFP陽性細(xì)胞到80%左右的陽性率后拿混合克隆進(jìn)行了qPCR和western驗證。qPCR用融合基因A的引物能正常擴增，且相對表達(dá)量比空載組高3000倍，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳也能看到明顯過表達(dá)的條帶。由于沒有該融合基因A的直接抗體，因此用flag抗體跑western，過表達(dá)組只有1次能見到非常弱的flag條帶。 然而最想不通的問題在這里—— 上面的混合克隆用流式分選單克隆后養(yǎng)了2周（此時GFP陽性率接近100%）再做qPCR和western，qPCR過表達(dá)了一萬多倍（顯然比混合克隆高很多），但是western跑了七八次（同樣的flag抗體）就是未見過表達(dá)組有flag條帶。此外，我想要研究的蛋白B，在單克隆組（隨機取了4組單克�。┖突旌峡寺〗M的表達(dá)結(jié)果也接近相反（混合克隆中過表達(dá)融合基因A組顯著高表達(dá)B，而單克隆中過表達(dá)組的B表達(dá)量反而低一些�；�?qū)用婧苊黠@，蛋白層面不太明顯）。 求助大家！�。� 1）為何基因?qū)用孢^表達(dá)明顯但蛋白層面幾乎看不出過表達(dá)？flag標(biāo)簽蛋白會丟失嗎？ 2）目的基因B在單克隆和混合克隆中的表達(dá)情況不一致，應(yīng)該以哪個結(jié)果為準(zhǔn)？ 如有想法請告知！新手實驗小白缺乏經(jīng)驗，請大家?guī)兔�！謝謝大家。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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2樓2020-05-18 07:20:23
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蛋白質(zhì)過表達(dá)出來是指沒有條帶嗎？是不是封閉沒做好或者提取蛋白質(zhì)的時候蛋白質(zhì)已經(jīng)降解了？ 3樓2020-05-18 09:01:37
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