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電轉(zhuǎn)染實驗效率低的原因有哪些?
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電轉(zhuǎn)染實驗效率低,可能是以下幾點原因: 1. 不合適的電場強度 合適的電場強度對于電轉(zhuǎn)染實驗非常重要,電場強度不能過高,過高會增加細(xì)胞的死亡率;也不能過低,過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細(xì)胞系具有不同的最佳場強值,實驗前應(yīng)測定所轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的最佳電場強度。 2. 細(xì)胞選擇錯誤 用于電轉(zhuǎn)的細(xì)胞一般選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞(15代以內(nèi),傳代后2d)。因為處于對數(shù)生長期的細(xì)胞分裂旺盛,表面結(jié)構(gòu)致密比穩(wěn)定期的細(xì)胞差,電轉(zhuǎn)后,細(xì)胞膜的恢復(fù)能力強,而且處于有絲分裂期的細(xì)胞更容易接受外源DNA. 3. 質(zhì)粒質(zhì)量不佳 應(yīng)選擇純度高的質(zhì)粒,首先DNA/RNA應(yīng)該超純(A260/A280>1.8),其次應(yīng)不含內(nèi)毒 素,同時質(zhì)粒應(yīng)溶于雙蒸水而不是TE緩沖溶液。另外,DNA濃度不宜過高。 4. 電轉(zhuǎn)染試劑不合適 電擊會對細(xì)胞造成一定程度的傷害,在轉(zhuǎn)染試劑的選擇上要注意,應(yīng)選擇具有細(xì)胞膜修復(fù)成分的電轉(zhuǎn)染試劑,如Entranster-E,可將電擊對細(xì)胞的損傷降到最低。并且,Entranster-E可適用于lonza、Bio-rad、BTX等多種電轉(zhuǎn)儀。 |
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