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你是路人甲銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染JURKAT細(xì)胞后，用G418篩選
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| 我正在用脂質(zhì)體2000做JURKAT細(xì)胞株轉(zhuǎn)染,用G418篩選后存貨或的細(xì)胞很少,同時(shí)這些細(xì)胞也不分裂增殖了，感覺也快死了.我準(zhǔn)備重新再做一次，這次打算先用PHA先把細(xì)胞株激活,再轉(zhuǎn)染,這樣能提高轉(zhuǎn)染效率嗎? |
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| 那樣做不能提高轉(zhuǎn)染效率,并且會(huì)使轉(zhuǎn)染后篩選更麻煩,激活后再轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體的毒性會(huì)更明顯。轉(zhuǎn)染失敗的原因a:轉(zhuǎn)染時(shí)間過長(zhǎng),脂質(zhì)體的后續(xù)毒性很大,b:加G418過早;c:G418梯度設(shè)置不好;d:未轉(zhuǎn)進(jìn)去。我們實(shí)驗(yàn)室用24孔板做，每孔2ulRFECT，設(shè)置siRNA終濃度10nM,30nM,50nM,100nM四個(gè)梯度，每個(gè)梯度做2個(gè)復(fù)孔，建議在轉(zhuǎn)染時(shí)一定要注意脂質(zhì)體的毒性,隨時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài),一旦細(xì)胞狀態(tài)變化要及時(shí)終止轉(zhuǎn)染,但轉(zhuǎn)染效率與轉(zhuǎn)染時(shí)間有一定的關(guān)系,太短的轉(zhuǎn)染時(shí)間會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)不進(jìn)去而轉(zhuǎn)染失敗,如果你的細(xì)胞比較耐受,你可以在嚴(yán)密監(jiān)視細(xì)胞的情況下盡量延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染時(shí)間。最好能設(shè)一個(gè)脂質(zhì)體的梯度,找到最佳脂質(zhì)體用量；延遲G418的加入時(shí)間,每一個(gè)G418濃度間隔時(shí)間延長(zhǎng) |
2樓2019-01-31 17:14:43
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